不同地理种源金线莲不同采集时间活性成分分析研究

曾碧玉 苏明华 陈清西 李惠华 常强 王伟

摘  要：對4个不同地理种源金线莲（‘三明尖叶、‘三明圆叶、‘漳州尖叶及‘台湾AF）种植满120 d时的生物量及活性成分进行分析比较。结果显示，单株鲜重和干重及多糖含量以‘漳州尖叶金线莲品种最高，而总多酚及总黄酮含量则均以‘台湾AF金线莲品种最高。同时对4个金线莲品种不同采集时间的活性成分进行分析比较。结果显示，除‘台湾AF金线莲品种外，其余3个品种的变化规律大致相同，即随着移栽时间的延长，总多酚及总黄酮含量缓慢增长，而多糖含量则递减。金线莲‘三明尖叶与‘三明圆叶品种中，总多酚及总黄酮含量均在种植满150 d达到最大值，此时，在‘三明尖叶金线莲中，总多酚及总黄酮含量分别为（9.81±0.24）、（4.62±0.16） mg/g;在‘三明圆叶金线莲中，总多酚及总黄酮含量分别为（9.27±0.22）、（4.60±0.17） mg/g。‘漳州尖叶金线莲品种的总多酚及总黄酮含量均在种植满120 d达到最大值，分别为（7.74±0.05）、（4.63±0.04） mg/g。‘三明尖叶、‘三明圆叶以及‘漳州尖叶金线莲品种的多糖含量分别于种植满90、0、120 d时达到最大值，多糖含量分别为（26.05±2.11）、（24.29±2.33）、（45.90±4.70） mg/g。此外，对‘三明尖叶与‘三明圆叶金线莲品种不同部位活性成分分析发现，多酚与黄酮主要在叶片累积，而糖类物质则主要在茎段累积。

关键词：金线莲;地理种源;采集时间;活性成分

中图分类号：R282.4      文献标识码：A

Abstract： The biomass and active ingredients of four cultivars （‘Sanming NL （narrow leaf）， ‘Sanming RL （round leaf）， ‘Zhangzhou NL and ‘Taiwan AF） of Anoectochilus roxburghii and Anoectochilus formosanus from different geographical sources were assayed 120 days after transplantation. The polysaccharides content， fresh weight and dry weight per plant of ‘Zhangzhou NL were significantly higher than that of the other three cultivars. Also， the total polyphenols and total flavonoids content of ‘Taiwan AF were significantly higher than that of the other three cultivars. The dynamic changes of the active ingredients in different collection periods were investigated. Except for ‘Taiwan AF cultivar， the variation rules of total polyphenols， total flavonoids and polysaccharides content in the three varieties were roughly the same. The content of total polyphenols and total flavonoids increased and the content of polysaccharides decreased with the extension of transplanting time. The content of total polyphenols and total flavonoids reached the maximum 150 days after transplantation for ‘Sanming NL and ‘Sanming RL. For ‘Sanming NL， the content of total polyphenols and total flavonoids was （9.81±0.24） and （4.62±0.16） mg/g， respectively. For ‘Sanming RL， the content of total polyphenols and total flavonoids were （9.27±0.22） and （4.60±0.17） mg/g， respectively. In ‘Zhangzhou RL， the content of total polyphenols and total flavonoids reached the maximum 120 days after transplantation. The content of total polyphenols and total flavonoids in ‘Zhangzhou RL was （7.74±0.05） and （4.63±0.04） mg/g， respectively. The content of polysaccharides reached the maximum 90， 0 and 120 days after transplantation for ‘Sanming NL， ‘Sanming RL and ‘Zhangzhou RL， respectively. The content of polysaccharides was （26.05±2.11）， （24.29±2.33） and （45.90±4.70） mg/g in ‘Sanming NL， ‘Sanming RL and ‘Zhangzhou RL， respectively. Besides， the analysis of the active components in different parts in the plant of ‘Sanming NL and ‘Sanming RL revealed that polyphenols and flavonoids were mainly accumulated in the leaves but sugars in the stems.

Keywords： Anoectochilus roxburghii; collection time; biological characteristics; active ingredients

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.024

金线莲[Anoectochilus roxburghii （Wall.） Lin?dl.]，为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoec?tochilus）多年生草本植物[1]。是我国传统的珍贵药材，民间素有“药王”、“金草”之美誉。其味甘微苦，性平微寒，具有清热凉血、祛风利湿、强心、固肾、利尿、平肝、降血压等功效，主要用于治疗高血压、糖尿病、心脏病、肺炎、急慢性肝炎、肾炎等症[2]。金线莲之所以具有多种功效归因于其具有多种活性成分，如多酚、黄酮、多糖、有机酸及挥发油等。

目前，金线莲来源广泛，福建多地均有种植。然而，对于不同地理种源金线莲的活性成分分析研究则较少[3-4]，或者主要集中于单一的活性成分分析[5]。而不同地理种源金线莲的活性成分分析研究具有一定的应用价值。因此，选取福建主产地（漳州、三明）金线莲以及市面上常见的原产于台湾的金线莲进行分析，以期为金线莲资源的开发利用以及栽培应用提供依据。

大量研究证实，采收期对果蔬与药材品质具有显著的影响[6]。目前，金线莲的采收尚无标准可依，不同采集时间的金线莲均有出售，栽培苗多以室外移栽满3～4个月或满6个月采收居多，尤其以种植满4个月采收最多。但关于金线莲不同采集时间活性成分的比较研究极少[7]。而系统研究金线莲不同采集时间活性成分变化规律具有重要的生产指导意义。基于此，本研究对金线莲不同采集时间活性成分的变化规律进行分析比较，以期为生产种植采收提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

福建三明、福建漳州及台湾金线莲组培苗，种植于厦门地缘生物科技有限公司的资源圃内，该资源圃位于北纬2446，东经1181，属于亚热带海洋性气候，年平均气温20.5 ℃，年平均降雨量1234 mm。本研究中供试金线莲品种包括福建三明尖叶品种、福建三明圆叶品种、福建漳州尖叶品种及台湾金线莲品种，分别表示为‘三明尖叶、‘三明圆叶、‘漳州尖叶及‘台湾AF。

没食子酸标准品（纯度≥98%）、福林酚试剂，Sigma公司;芦丁标准品（纯度≥98%），天津一方科技有限公司;无水乙醇、碳酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠及亚硫酸钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

Lambda 25紫外/可见光光谱仪，美国Perkinelmer股份有限公司。

1.2  方法

1.2.1  形态特征调查与描述  大棚移栽种植实验于2013年在厦门地缘生物科技有限公司大棚内进行。培养基质主要为泥炭土，采用口径为8 cm的培养钵作为培植载体，每钵种植金线莲1株。栽培大棚采用聚乙烯薄膜，外层加盖遮阳网，大棚试验金线莲管理与大棚其他金线莲日常管理相同。

金线莲定植后，每月定期采收。采收后，每个品种均随机挑选15株进行生物学性状及生物量调查。软尺测量茎高并用数显游标卡尺测量茎粗，其中茎高计量为顶芽抽出处至茎基部距离，茎粗计量为茎最粗处直径大小。选取植株中的最大叶片，用软尺测量叶长及叶宽。计算植株含叶片数。同时测定单株鲜重及干重。单株鲜重为单株材料清洗并擦拭干水分后称重所得。单株干重为测定完鲜重后于50 ℃烘箱烘干至恒重后称重所得。

1.2.2  实验材料预处理  金线莲采收后，先用流水清洗干净，后用蒸馏水润洗，50 ℃烘箱烘干至恒重，用粉碎机研磨成粉末，过40 目筛，得金线莲干燥粉末，密封低温贮存备用。

1.2.3  總多酚、总黄酮及多糖提取方法  准确称取一定量的金线莲干燥粉末，按1∶60（g/mL）料液比加入60%的乙醇溶液。置于摇床120 r/min、25 ℃振摇48 h。过滤、取滤液并定容，测定滤液中多酚及黄酮含量，并计算金线莲中多酚及黄酮含量。滤渣按1∶60（g/mL）料液比加入蒸馏水，60 ℃水浴1.5 h，过滤，取滤液并定容，测定滤液中总糖及还原糖的含量，并计算多糖含量。

1.2.4  总多酚含量测定  采用Folin-Ciocalteu法，参照Zuo等[8]所述方法并加以修改。

标准没食子酸溶液配制（5.00 mg/mL）：精确称取没食子酸500 mg，先用蒸馏水溶解并定容至100 mL，摇匀。

标准曲线的制作：将上述标准溶液稀释100倍后得到50 μg/mL的没食子酸溶液。在各比色管中，分别加入0、100、200、300、400、500、600、700、800 μL的没食子酸溶液，补足蒸馏水至2.00 mL，混匀。每管再分别加入1.00 mL福林酚试剂，混匀后反应4 min。各管中再分别加入1.00 mL的Na2CO3溶液（10%），避光室温条件下静置2 h。以蒸馏水为参比，于765 nm波长处测定吸光值。每样各重复3次。以没食子酸标准品含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制总多酚标准曲线方程为y=0.0246x，相关系数R2=0.9980。

样品含量测定：取1.00 mL样品溶液，同上法操作，测定吸光度值，按所得的总多酚标准曲线方程计算样品中总多酚含量，总多酚含量以没食子酸当量表示，结果表示为mg/g。

1.2.5  总黄酮含量测定  采用 NaNO2-Al（NO3）3- NaOH比色法，参照Sheng等[9]所述方法并略加修改。

标准芦丁溶液的配制（100 μg/mL）：精确称取10 mg芦丁（105 ℃干燥至恒重），加适量60%乙醇，水浴中加热溶解，待冷却后，用60%乙醇定容至100 mL，摇匀。

标准曲线的制作：于具塞试管中，分别加入0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL芦丁标准液，分别补加60%乙醇至5.00 mL，混匀。再分别加300 μL NaNO2溶液（5%），混匀，反应6 min。再分别添加300 μL Al（NO3）3溶液（10%），再次混匀，静置反应6 min。然后，分别加4.00 mL NaOH溶液（1 mol/L），混匀。最后，分别加400 μL 60%的乙醇溶液，摇匀。放置10 min后，以60%乙醇为参比，于510 nm波长处测定吸光值。每样均设3次重复。以芦丁标准品含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制总黄酮标准曲线方程为y=1.8655x，相关系数 R2=0.9999。

样品含量测定：准确吸取1.00 mL样品溶液，操作步骤同上，测定吸光度值，按上述总黄酮标准曲线方程计算样品中的总黄酮含量。总黄酮含量以芦丁当量表示，结果表示为mg/g。

1.2.6  总糖含量测定  总糖含量测定采用苯酚-硫酸法，参照曾碧玉等[10]所述方法。简言之，即1.0 mL样品液，加5 %苯酚溶液1 mL，振摇混匀，加入5.00 mL浓硫酸，迅速振摇混匀，静置30 min。而后在490 nm测定其吸光度。每样均设3次重复。以葡萄糖标准品含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制总糖标准曲线方程为y=0.0094x?0.0001，相关系数R2=0.9995。

样品含量测定：取样品溶液1.00 mL，按上述步骤操作，测定吸光值，按总糖标准曲线方程来计算样品中总糖含量。总糖含量以葡萄糖当量表示，结果表示为mg/g。

1.2.7  还原糖含量测定  还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法，参照李合生[11]所述方法，即1.0 mL样品液，补加蒸馏水至2.00 mL。加入1.5 mL DNS 试剂，混匀，沸水浴5 min，流水冲洗冷却至室温，用蒸馏水补足至25 mL，摇匀。在 540 nm 测定其吸光度。每样均设3次重复。以葡萄糖标准品含量（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制还原糖标准曲线方程为y=0.5315x?0.016，相关系数R2=0.9982。

样品含量测定：取样品溶液1.00 mL，按上述步骤操作，测定吸光值，按还原糖标准曲线方程来计算样品中还原糖含量。还原糖含量以葡萄糖当量表示，结果表示为mg/g。

1.2.8  多糖含量测定  样品中多糖含量按公式计算：

多糖含量=总糖含量?还原糖含量

多糖含量以葡萄糖当量表示，结果表示为mg/g。

1.3  数据处理

生物量与活性成分测定数据分别为15次与3次平行试验结果，数据表示形式为“平均值± SD”。方差分析均采用SPSS 11.5软件进行。

2  结果与分析

2.1  不同地理种源金线莲生物学特征与活性成分比较分析

2.1.1  形态特征描述  不同地理种源金线莲大棚移栽满120 d植株形态如图1所示。‘三明尖叶金线莲品种植株高8.5～11.9 cm。茎基部匍匐，淡红褐色，光滑，肉质，长6.5～8.4 cm，粗1.7～2.4 mm。茎上具节，基部节上有不定根，淡绿色。根3～5条，被有茸毛，米黄色，最长根根长为1.1～2.9 cm。叶为单叶互生，叶5～7枚，叶片卵圆形或卵形，最大叶叶长2.1～2.9 cm，叶宽1.3～1.8 cm，叶面墨绿色，具金红色网脉，背面淡紫红色，叶缘全缘或具微圆齿状，叶端渐尖（图1A）。

‘三明圆叶金线莲品种植株高7.0～10.5 cm。茎基部匍匐，淡红褐色至紫紅色，光滑，肉质，长5.2～8.0 cm，粗2.1～2.7 mm。茎上具节，基部节上有不定根，淡绿色。根2～5条，被有茸毛，米黄色，最长根根长为1.8～4.5 cm。叶为单叶互生，叶数5～7枚，叶片卵圆形或近圆形，最大叶叶长2.0～2.5 cm，叶宽1.6～1.9 cm，叶面墨绿色，具金红色网脉，背面浅暗红色，叶缘圆齿状，叶端渐尖（图1B）。

‘漳州尖叶金线莲品种植株高9.0～14.3 cm。茎基部匍匐，淡红褐色，光滑，肉质，长7.0～ 11.3 cm，粗2.3～3.0 mm。茎上具节，基部节上有不定根，淡绿色。根4～6条，被有茸毛，米黄色，最长根根长为2.4～6.4 cm。叶为单叶互生，叶5～8枚，叶片卵圆形或卵形，最大叶叶长2.7～3.6 cm，叶宽1.7～2.4 cm，叶面墨绿色，具金红色网脉，背面淡紫红色，叶缘全缘或具微圆齿状，叶端渐尖（图1C）。

‘台湾AF金线莲植株高9.2～11.6 cm。茎基部匍匐，微红褐色，光滑，肉质，长6.7～9.2 cm，粗2.1～3.1 mm。茎上具节，基部节上有不定根，淡绿色。根3～6条，被有茸毛，米黄色，最长根根长为1.7～3.7 cm。叶为单叶互生，叶3～6枚，叶片卵圆形或卵形，最大叶叶长2.2～2.8 cm，叶宽1.5～ 2.2 cm，叶面翠绿色，具银白色网脉，背面微紫红色，叶缘全缘或具微圆齿状，叶端渐尖（图1D）。

2.1.2  生物量  不同地理种源金线莲大棚移栽满120 d的单株鲜重与单株干重如表1所示。4个品种中，单株鲜重及单株干重均以‘漳州尖叶金线莲品种最高，分别达（1496±375）、（138±36）mg，显著高于其他品种。单株鲜重高低顺序为‘漳州尖叶>‘台湾AF>‘三明圆叶>‘三明尖叶。单株干重高低顺序为‘漳州尖叶>‘三明圆叶>‘台湾AF>‘三明尖叶。

2.1.3  活性成分  不同地理种源金线莲大棚移栽满120 d的活性成分分析如表2所示。4个品种中，总多酚及总黄酮含量均在‘台湾AF金线莲品种中最高，分别为（9.33±0.18）、（4.55±0.06）mg/g，顯著高于其他3个品种。总多酚及总黄酮含量的高低顺序在4个品种中均表现一致，其排序为‘台湾AF>‘三明圆叶>‘三明尖叶>‘漳州尖叶。多糖含量以‘漳州尖叶金线莲中最高，为（45.90± 2.71） mg/g，显著高于其他3个品种，可分别高达3.57～4.88倍。多糖含量的高低顺序在4个品种中为‘漳州尖叶>‘三明尖叶>‘台湾AF>‘三明圆叶。

2.2  同一地理种源金线莲不同采集时间比较分析

2.2.1  生物量  4个金线莲品种在不同采集时间单株鲜重及单株干重比较分析如表3所示。4个金线莲品种的单株鲜重随着移栽时间的延长呈现一定的增长趋势。‘三明尖叶、‘三明圆叶、‘漳州尖叶与‘台湾AF金线莲品种种植满180 d的植株其单株鲜重分别达（841±218）、（826±267）、（1705±334）、（1285±213） mg。方差分析显示，与移栽满0 d的植株相比，‘三明圆叶、‘漳州尖叶与‘台湾AF金线莲品种种植满180 d植株的单株鲜重可达显著性提高。

4个金线莲品种在不同采集时间单株干重比较分析如表4所示。4个金线莲品种中，‘三明尖叶金线莲随着移栽时间的延长，其单株干重呈现一定的波动;其余3个品种的单株干重随着移栽时间的延长均呈现一定程度的增长趋势。与移栽满0 d的植株相比，‘三明圆叶、‘漳州尖叶与‘台湾AF金线莲种植满180 d的植株其单株干重均有显著性增加，分别达（65±26）、（185±30）、（98±19）mg。

2.2.2  活性成分  4个金线莲品种在不同采集时间的活性成分比较分析结果见图2。4个品种中，‘台湾AF金线莲的总多酚与多糖含量随着移栽时间的延长呈现一定的波动;其余3个品种在不同采集时间的活性成分变化规律大致相同，即随着移栽时间的延长，总多酚及总黄酮的含量缓慢增长，而多糖含量则递减。‘三明尖叶金线莲中，总多酚与总黄酮含量均在种植满150 d时达最大值，分别为（9.81±0.24）与（4.62±0.16）mg/g。多糖含量在移栽满90 d时达最大值，为（26.05±2.11）mg/g。‘三明圆叶金线莲中，总多酚、总黄酮含量均在种植满150 d时达最大值，分别为（9.27±0.22）与（4.60±0.17） mg/g;多糖含量在移栽满0 d时达最大值，为（24.29±2.33）mg/g。‘漳州尖叶金线莲中，总多酚、总黄酮含量均在种植满90 d时达到最大值，分别为（7.74±0.05）与（4.63±0.04）mg/g;多糖含量在移栽满120 d时达最大值（45.90±4.70）mg/g。‘台湾AF金线莲中，总多酚含量在移栽满30 d时达到最大值（9.66±0.06）mg/g;总黄酮含量在种植满120 d时达到最大值（4.55±0.06）mg/g;多糖含量在移栽满150 d时达最大值（16.31±0.79）mg/g。

2.3  同一地理种源金线莲不同部位活性成分比较分析

进一步对金线莲的不同部位活性成分进行分析比较。分别选取同一生长期的‘三明尖叶和‘三明圆叶金线莲的叶及茎进行活性成分分析，结果如表5所示。2个品种中叶及茎活性成分含量规律一致，均表现为：叶中总多酚及总黄酮含量高于茎中含量，即叶>茎;而对于多糖含量，则以茎中为高，即茎>叶;且均达显著性差异。

2.4  生物学性状与活性成分相关性分析

对不同地理种源金线莲7个采集时间的生物学性状与活性成分的相关性进行综合分析，结果如表6所示。其中，在0.01水平，单株鲜重与单株干重呈显著正相关;总多酚与总黄酮呈显著正相关;单株鲜重分别与叶长、叶宽、茎高、茎直径呈显著正相关;单株干重分别与叶长、叶宽、茎高呈显著正相关;多糖含量与叶长、单株鲜重、单株干重呈显著正相关;多糖含量与总多酚含量呈显著负相关。在0.05水平，总多酚含量与总黄酮含量呈显著正相关。

3  讨论

在金线莲中，生物量是经济效益的重要指标之一。总多酚、总黄酮及多糖是金线莲的重要活性成分，也是评价金线莲品质的重要指标。本研究中，至移栽满120 d时，不同地理种源金线莲中，单株鲜重及单株干重均以‘漳州尖叶金线莲最高，可分别比其他品种显著高达1.62～2.34倍及2.06～2.71倍。同时，与其他品种相比较，‘漳州尖叶金线莲中多糖含量最高，可分别高达3.57～4.88倍。此外，生物学性状与活性成分的相关性结果也表明，生物量与多糖含量呈显著正相关。可见，‘漳州尖叶金线莲在生物量以及糖类物质资源开发上具有较佳的优势，建议推广应用。本研究中还发现‘台湾AF金线莲品种也值得关注，至移栽满120 d时，其单株鲜重及单株干重仅次于‘漳州尖叶品种。同时，活性成分分析显示，总多酚及总黄酮含量在‘台湾AF金线莲中最高，显著高于其他3个品种。可见，在生物量、多酚及黄酮资源开发利用上，‘台湾AF金线莲品种具有一定的优势，具有很好的推广应用前景。当然，为更好的优选适于推广应用的品种，还需进一步筛选更多的不同地理种源品种。

目前，金线莲的合适采集时间尚无标准可依，而金线莲不同采集时间活性成分呈现出一定的差异[7]，因此，系统研究金线莲不同采集时间活性成分动态变化具有重要的研究意义。本研究中，除‘台湾AF金线莲品种外，其余3个金线莲品种中，总多酚与总黄酮含量呈现出大致相同的动态变化规律，即随着栽培时间的延长而增长;而多糖含量则相反，随栽培时间的延长呈递减趋势。前人研究中发现，金线莲在移栽满120 d时的总黄酮含量高于移栽0 d的植株;而多糖含量则相反，以移栽0 d的植株为高[12-14]。可见，本研究中发现的总黄酮与多糖含量动态变化规律与这些研究结果相一致。此外，相关性分析也表明，总多酚含量与总黄酮含量呈显著正相关。因此，若以总多酚或总黄酮开发为生产目的，可选用移栽苗;但若以多糖开发为生产目的，可直接选用组培苗。‘台湾AF金线莲品种中，与其余3个品种相比较发现，随着移栽时间的延长，仅总黄酮含量变化与其余3个品种大致相同，呈现上升趋势。而总多酚与多糖含量的变化规律则不一致，呈现一定的波浪线型起伏变化。这很大程度上可能归因于品种差异。

本研究中，在‘三明尖叶金线莲与‘三明圆叶金线莲中，叶中总多酚及总黄酮含量显著高于茎，但其多糖含量则显著低于莖。蒋元斌[7]研究认为，总黄酮主要累积在叶片，茎段部位较少。陈晓兰等[15]研究认为，金线莲根茎部的多糖含量高于叶中多糖含量。可见，本研究中不同部位总黄酮与多糖含量分析结果与蒋元斌[7]及陈晓兰等[15]研究报道相一致。说明总多酚与总黄酮主要在叶片中累积，而糖类物质则主要在茎段中累积。此研究为金线莲活性成分开发利用及优良品种开发推广提供参考。

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