茉莉酸对莱茵衣藻代谢降解杀菌剂三氯生的影响机制

张晨怡，毛佳昊，苗馨文，刘 汀，熊晓辉，卢一辰

(南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

三氯生(triclosan,TCS)的化学名称为2,4,4′-三氯-2′-羟基二苯醚,被广泛应用于个人护理产品、医疗用品中[1]。长期以来，随着生活污水大量排放，残留在各种环境中的三氯生被大量检出，对水体环境造成极大污染。近年来，三氯生对水生动植物的急慢性毒性效应和致畸作用被广泛报道和关注[2-3]。2013年美国食品药品监督局宣布在日化用品中禁止使用三氯生。环境中大量残留的三氯生可以通过食物链传递对人类健康构成潜在威胁。因此，迫切需要研究高效绿色的三氯生降解方式。

微藻不仅是水生动物赖以生存的营养来源，也是水体环境中重要的代谢分解者。大量研究表明藻类能够富集、浓缩和降解水体中化学污染物，例如：重金属、农药和可持续性有机污染物等[4-5]。莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是一种生长周期和传代时间短、可固体或液体培养的单细胞真核绿藻，由于其具有遗传背景和基因结构清晰、易于分子生物学研究等特点，常被用作理想的模式生物[6]。梁永莉等[7]发现莱茵衣藻对双酚A具有一定的富集和降解能力。因此，激发藻类富集降解双酚A等化学污染物的能力在环境修复应用中具有很大的潜在价值。

茉莉酸类物质(jasmonates，JAs)广泛存在于高等植物体内，主要包括茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)，参与调节植物生长发育过程。近年来研究发现茉莉酸及其衍生物可作为信号分子诱导植物体内防御基因的表达，调节植物对外源生物或者非生物胁迫的防御响应。Armagan等[8]发现茉莉酸处理可提高烟草细胞内谷胱甘肽S-转移酶、抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶系的活力，缓解了甲咪唑烟酸对烟草的毒性作用。然而茉莉酸对微藻代谢外源有机污染物方面的研究还未见报道。本文中，笔者以莱茵衣藻为受试物，茉莉酸为研究对象，三氯生为处理试剂，从植物生理、酶学响应以及毒物积累代谢3个方面研究茉莉酸对莱茵衣藻应答三氯生胁迫反应和代谢降解三氯生的影响机制，旨在建立一种通过激发微藻内源代谢来提高水体中三氯生降解效率的绿色环境修复方式。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LRH-150-S型恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂；SW-C-1F型单人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；5471R型台式离心机，德国Eppendorff公司；GL-20G-II型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；SPECTRUMLAB型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯科技有限公司；JY92-IID型超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所；DL型24位固相萃取装置，上海秉越电子仪器有限公司；Agilent2000型高效液相色谱仪，苏州赛恩斯仪器有限公司。

分析纯的NH4Cl、K2HPO4和KH2PO4，西陇化工股份有限公司；分析纯的冰醋酸、甲醇、乙醇和丙酮，上海凌峰化工有限公司；文中所用试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 莱茵衣藻的培养和实验设置

参考文献[9]方法配制TAP藻培养基，并于121℃灭菌20 min，冷却备用。接种一定体积的藻液至TAP培养基内，25±2 ℃、相对湿度50%±5%、8 h/16 h的光/暗条件进行培养。待莱茵衣藻生长至对数期(OD600为0.6～0.8)后，按照实验设置需求以每瓶50 mL进行分装。

在生长量、叶绿素、电导率和丙二醛测定中，实验设置7个处理组和1个对照组，具体为①空白对照组(CK)为未处理三氯生和茉莉酸；②0.05 JA为仅0.05 μmol/L茉莉酸处理；③0.15 JA为仅0.15 μmol/L茉莉酸处理；④0.45 JA为仅0.45 μmol/L茉莉酸处理；⑤TCS为仅2 mg/L三氯生处理；⑥0.05 JA+TCS为0.05 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同处理；⑦0.15 JA+TCS为0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同处理；⑧0.45 JA+TCS为0.45 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同处理。每组设置3个平行。

1.3 莱茵衣藻生长量测定

准确吸取2 mL对数期的藻液，分别稀释2、4、6、8、10倍，在750 nm处测定各稀释度藻液的吸光值。同时取上述1 mL各稀释度的藻液，经过鲁哥氏溶液固定后，在普通光学显微镜下，用血细胞计数板计数。根据藻的细胞数与OD600的线性关系得细胞数标准曲线y=18.12x-0.212 7(R2=0.997 4)。

取对数生长期的藻液按1.2节实验设置进行处理，在0、24、48、72和96 h分别取样，测定其在750 nm处的吸光值A750，根据上述标准曲线计算细胞数[10]。

1.4 细胞光合色素测定

取对数生长期的藻液按1.2实验设置进行处理，处理后96 h取样，用80%乙醇提取色素，采用光密度法测定665 nm处吸光值，按式(1)来计算细胞总叶绿素含量[11]。

ρ(总叶绿素)=(6.10A665+20.04A649)×0.6

(1)

1.5 电导率的测定

取对数生长期的藻液按1.2节实验设置进行处理，在24、48、72、96 h分别取样，并用电导仪测定初始电导率，记为E0。将样品置于25 ℃下30 min，记录此刻电导率为E1。再将样品置于95 ℃水浴20 min，再次测定电导率，记为E2。通过式(2)计算电导率E。

(2)

1.6 丙二醛的测定

取对数生长期的藻液按1.2实验设置进行处理，在0、24、48、72和96 h分别取样，采用丙二醛(MDA)测试盒(货号：A0031，TBA法)测定细胞内丙二醛含量。

1.7 莱茵衣藻抗氧化酶活力测定

取对数生长期的藻液设置对照组和处理组，分别为①空白对照组(CK)为未处理三氯生和茉莉酸；②0.15 JA为仅0.15 μmol/L茉莉酸处理；③TCS为仅2 mg/L三氯生处理；④0.15 JA+TCS为0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同处理，每组设置3个平行。将各组藻液10 000 r/min离心10 min，去上清液，加入3 mL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)，混匀后在冰浴保护下进行细胞破碎后10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，保存待用。依照试剂盒操作说明测定各组细胞中过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、多酚氧化酶(PPO)酶活力。

1.8 莱茵衣藻体内三氯生积累量测定和代谢产物分析

取对数生长期的藻液设置对照组和处理组，分别为①TCS为仅2 mg/L三氯生处理；②0.15 JA+TCS为0.15 μmol/L茉莉酸和2 mg/L三氯生共同处理，每组设置3个平行。每个处理各取80 mL的藻液，10 000 r/min离心20 min，分别收集藻细胞和30 mL上清液待处理。将30 mL上清液完全通过C18固相萃取柱，用3 mL 80%(体积分数)甲醇溶液洗脱并过0.22 μm滤膜后上机检测。

收集藻细胞中加入75%(体积分数)的丙酮溶液10 mL，室温下超声提取10 min。10 000 r/min离心6 min后取上清液。将上清液氮吹至剩水相，过C18固相萃取柱，用3 mL 80%(体积分数)甲醇溶液洗脱并过0.22 μm滤膜后上机检测。液相色谱条件：色谱柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温30.0 ℃；进样体积20.0 μL；流速1.0 mL/min；流动相甲醇和水(体积比75∶ 25)；检测器为紫外检测器；检测波长230 nm。质谱条件为ESI正离子模式；扫描范围为50～1 000；分析模式为IDA；裂解能量为10 eV。

1.9 数据统计与分析

用单因素分析法进行数据分析，所有数据均使用Excel软件进行统计处理，采用标准差对各处理组之间的差异进行统计学处理，并进行显著性差异分析(P<0.05)，图中显著性差异均用字母(a、b、c、d)或*标注。生理指标数据至少重复3次，代谢数据至少重复2次，使用Origin软件进行作图。

2 结果与讨论

2.1 茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻细胞数的影响

茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻细胞数的影响如图1所示。

图1 茉莉酸作用对三氯生胁迫下莱茵衣藻细胞数的影响

由图1可知，TCS处理组藻细胞数随着处理时间增加而逐渐降低。加药处理24 h的藻细胞数为对照组的78.60%，48 h时仅为对照组的50.03%。可见，TCS对莱茵衣藻生长有明显抑制作用。当加入0.05、0.15和0.45 μmol/L茉莉酸处理96 h后，藻细胞数分别是单独TCS处理组的2.38、2.50和2.54倍。可见，外源施用茉莉酸缓解了TCS对细胞衰亡的促进作用。然而，从仅JA处理组和对照相比来看，在0.45 μmol/L JA处理24 h的细胞数仅为CK组的78.40%，到96 h时仅为CK组的52.39%，说明高浓度茉莉酸处理反而抑制了藻细胞生长。

2.2 茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻丙二醛的影响

丙二醛是当组织体内的器官衰老凋亡或受到外界逆环境刺激时，细胞质膜发生的过氧化最终产物之一，是衡量细胞损伤程度的重要因素[12]。茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻(以其鲜质量来计算)丙二醛含量的影响如图2所示。

图2 茉莉酸作用对三氯生胁迫下莱茵衣藻丙二醛(MDA)含量的影响

由图2看出，CK组MDA含量仅为TCS组的26.9%，说明莱茵衣藻细胞在三氯生作用下发生膜脂过氧化。当加入茉莉酸后，被三氯生诱导上升的MDA含量均有明显下降。可见，JA缓和了TCS对莱茵衣藻的氧化胁迫。

2.3 茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻叶绿素含量的影响

叶绿素是莱茵衣藻进行光合作用的重要元素，具有吸收、传递以及转化光能的作用。在环境因素胁迫下，叶绿素含量往往会降低，进而导致光合作用下降[12]。茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻叶绿素含量的影响如图3所示。

图3 茉莉酸作用对三氯生胁迫下莱茵衣藻总叶绿素含量的影响

由图3可知，与对照组(CK)相比，TCS处理显著降低了莱茵衣藻叶绿素含量。但是，随着外源添加茉莉酸从0.05 μmol/L升至0.45 μmol/L，莱茵衣藻叶绿素含量也逐渐恢复。特别在0.45 μmol/L JA处理后，叶绿素含量与TCS处理组相比增加了53.2%。单独添加0.15 μmol/L JA的莱茵衣藻与对照组相比，叶绿素含量是对照组的1.33倍，进一步说明茉莉酸可以提高莱茵衣藻光合作用。

2.4 茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻电导率的影响

当受到外界环境的胁迫时，细胞质膜往往最先作出反应，导致其选择透过性降低或丧失，因此质膜通透性的变化可以反映出细胞功能受损程度[13]。考察茉莉酸对三氯生胁迫下莱茵衣藻电导率的影响，结果如图4所示。

图4 茉莉酸作用对三氯生胁迫下莱茵衣藻电导率的影响

从图4可知，在0 h时各受试组电导率几乎无差异。在96 h时，TCS组的相对电导率最高，是CK组的1.03倍；JA组和TCS+JA组的电导率均比TCS处理组低。可见，JA改善了因TCS造成的藻细胞通透性改变。

2.5 茉莉酸作用下三氯生对莱茵衣藻抗氧化酶活力的影响

三氯生处理导致藻细胞中MDA含量增加，并伴随着电解质渗漏增大，显示细胞膜发生了膜脂过氧化而被氧化损伤。过氧化物酶(POD)作为抗氧化体系中重要组成之一，主要作用是将植物体内过量的活性氧转化为H2O，缓解胁迫。在茉莉酸作用下，三氯生对莱茵衣藻抗氧化酶活力的影响如图5所示。由图5(a)可知，TCS处理提高了POD酶活力，比CK增高了1.74%；而外源施用JA后，其酶活力与CK组相比均有下降，分别为30.34%和15.41%。可能的原因是JA加强了藻自身对活性氧自由基的清除，缓解了三氯生的氧化胁迫作用，导致POD酶活力降低。

图5 茉莉酸作用下三氯生对莱茵衣藻抗氧化体系的影响

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是植物体内重要的II相解毒酶，其主要功能是催化某些内源的或外来有害物质的亲电子基团与还原型的谷胱甘肽相偶联，增强其疏水性，使其易于被排出细胞膜，从而缓解有害物质的毒害，达到解毒的目的[14]。由图5(b)可知，三氯生胁迫激发了GST的活性，TCS处理组GST活力比CK提高了37.83%。相反，TCS+JA组与TCS组相比，其酶活力下降了26.83%，和 POD酶活力趋势一致。进一步说明茉莉酸存在下细胞毒性减少，GST酶活力的诱导效应减弱。

多酚氧化酶(PPO)，是多酚化合物氧化过程中的关键酶[14]。多酚氧化酶在植物体内广泛存在，当机体内自由基大量存在时会诱导PPO大量表达，因此可以作为细胞的氧化指标之一[15]。由图5(c)可知，与CK组相比，TCS组的PPO活力提高了328.14%，JA组的PPO活力下降了56.20%，TCS+JA组的PPO活力下降了91.15%。进一步表明外源茉莉酸的加入促进了藻细胞对自由基的清除，藻细胞体内自由基的积累量下降，PPO活性降低。

2.6 茉莉酸对莱茵衣藻体内三氯生积累量的影响

茉莉酸对莱茵衣藻体内三氯生积累量的影响如图6所示。由图6(a)可得，TCS处理组藻细胞内三氯生含量明显较高，是TCS+JA处理组的1.67倍。然而两组培养基内三氯生含量无显著差异(图6(b))。可见，茉莉酸促进了藻细胞内三氯生的代谢降解而非促进藻细胞对三氯生的吸收，减轻了三氯生对藻细胞的毒害作用。

图6 藻细胞内三氯生积累量(a)及其培养基中残留量(b)

2.7 茉莉酸对莱茵衣藻体代谢三氯生的影响

利用高分辨液质联用鉴定了茉莉酸处理下莱茵衣藻体内三氯生的代谢产物(表1和图7)。通过离子流图对比，筛出空白对照组(CK)没有、而在TCS处理组和TCS+JA处理组新增的峰作为三氯生代谢产物，并根据该峰的质谱信息解析化学结构。

表1 三氯生代谢产物质谱信息

使用四级杆飞行时间质谱仪进行全扫描，得到其对应的离子流图，将不同加药处理组的离子流图进行对比(图7)，其中CK组和TCS处理组没有检出，而TCS+JA样本组中检出的产物是JA作用于莱茵衣藻而导致TCS代谢的新产物。

红色线表示TCS+JA处理组；绿色线表示TCS处理组；蓝色线表示空白对照组

不同处理组细胞内三氯生代谢产物的相对丰度如图8所示。由图8可知，共检出三氯生代谢产物共6种(M1～M6)，其中仅在TCS+JA组检出有4种，分别是M1(m/z464)、M2(m/z495)、M3(m/z510)和M4(m/z313)。根据二级碎片离子信息推断降解产物结构，M1(m/z464)脱落1个OH—Glucose基团(m/z197)形成m/z267的主要碎片离子；M2(m/z495)和M1(m/z464)的主要碎片离子都有m/z267，M2(m/z495)是形成M1(m/z464)的前提化合物，此2种降解产物均为糖基化Ⅱ相代谢物；M3(m/z510)的主要碎片离子为m/z254，推测为脱去一个氯原子的三氯生，因此该化合物M3推测为双脱氯三氯生结合物；M6(m/z585)比M3(m/z510)多了75，推测其为M3的甘氨酸结合物(Ala-M3)；M4(m/z313)的主要碎片离子为m/z153，该碎片离子推测分子式为C8H9OS·，因此M4化合物推测为硫乙基取代的三氯生。

图8 不同处理组细胞内三氯生代谢产物相对丰度

对代谢产物进行相对丰度比较发现，有茉莉酸处理的藻细胞体内代谢产物丰度显著大于仅三氯生处理组。从质荷比看出，藻细胞内检出的代谢产物的质荷比均大于母体农药三氯生(m/z287)，因此可推测其降解产物均为Ⅱ相代谢缀合物。Ⅱ相代谢是高等植物解毒外源化学物的重要生物转化过程。可见，茉莉酸激活了藻体内代谢解毒体系，使三氯生向Ⅱ相代谢途径进行。

3 结论

1)在2 mg/L TCS加药处理下，通过对莱茵衣藻细胞数、叶绿素、电导率和丙二醛4个生理指标测定，发现外源茉莉酸可以缓解三氯生对莱茵衣藻的氧化胁迫。

2)测定了不同处理条件下，莱茵衣藻细胞内POD、GST和PPO的酶活。对比分析发现，TCS+JA组酶活明显下降，说明外源茉莉酸的加入促进了藻细胞对自由基的清除，降低了对酶活的诱导效应。

3)通过高效液相色谱准确测定了TCS和TCS+JA处理组藻体内和相应培养液中三氯生的积累量和残留量。分析发现，TCS+JA组藻体内三氯生含量较TCS组明显降低，然而培养基内TCS残留量并无显著性差异，说明茉莉酸通过促进三氯生的降解，而非促进藻细胞对三氯生的吸收，从而缓解三氯生对藻细胞的毒性作用。

4)通过高分辨质谱鉴定了三氯生在TCS和TCS+JA处理藻体内和相应培养液中的降解产物。一共筛查到了6种降解产物。值得注意的是，TCS+JA处理组藻体内大多数降解产物的相对含量显著大于TCS处理组，进一步说明了茉莉酸促进了三氯生在藻体内的代谢。