食品中环境激素的检测方法研究进展

於明珠，卫 伟，刘安然，刘松琴

(东南大学 化学化工学院 江苏省富碳材料与器件工程实验室，江苏 南京 211189)

环境激素是一类能够扰乱生物体正常平衡激素水平的外源性物质。它的来源很多，例如来自农业残留、工业残留、医疗废物甚至人类的生活垃圾等[1]。环境激素在自然界中会累积残留，以不同的形式进入生物体内后，会不可避免地干扰动物及人类身体的多个系统的正常工作，可能导致儿童性早熟、记忆力下降、大脑退化、不孕不育等多种疾病的发生，严重的甚至可能引发器官病变和产生肿瘤等[2-4]。2011年的一次食品安全的重大危机——“塑化剂事件”，导致了许多食品产业中的产品被塑化剂污染，使得人们对于食品安全的信任度越来越低。由于缺乏高效的食品安全监管及齐全的法律制度制约，社会迫切需求建立针对食品中的环境激素类污染物的快速、高灵敏度、高特异性的检测方法。

因此，笔者基于环境激素的结构特点和物化特性，综述目前针对环境激素类小分子的检测方法的研究进展，对传统的色谱、质谱检测方法的原理和检测水平进行总结，以期为后续研究提供参考。

1 环境激素的种类及危害

1.1 环境激素的种类

环境激素类物质种类繁多，目前已掌握的有可能扰乱生物内分泌的化学物质有70余种[1]，主要包括有机化合物，如苯并芘、双酚A(BPA)、二苯酮、邻苯二甲酸酯、苯乙烯、二噁英等；杀虫剂，如β-六氯化苯(β-六六六)、甲萘威、氯丹等；金属元素，如镉、铅、汞等；天然和合成的激素药物，如雌三醇、雌酮、己烯雌酚等[1]。

1.2 环境激素的危害

如果人们长期暴露于环境激素中，会对人体的内分泌系统、神经系统、生殖系统、免疫系统等造成严重的负面影响。因为环境激素可以与天然激素受体结合，干扰人体正常的激素分泌，引发内分泌系统的紊乱，其作用机制如图1所示[5]。另外，它还可能导致神经系统功能障碍、智力低下，甚至改变某些基因，造成细胞增殖、变异或癌变；环境激素是女性男性化和男性女性化的最大诱因，使男性的精子密度锐减；育龄妇女如果长期暴露于环境激素中，将明显增加胎儿的畸形发生率[6-9]。

图1 环境激素作用机制及影响[5]

环境激素是食品安全中的高危险因素。食品包装是食品中环境激素污染的重要来源，例如壬基酚常被用作增塑剂等用于塑料品的制造过程中，一旦食品的储存时间过长或者产品被加热或微波处理，壬基酚等残留物质就有极大可能污染食品，甚至被人体摄入，危害人体健康[10]。马强等[11]测定30件塑料、纸、陶瓷、橡胶等不同材质的食品包装材料样品中的壬基酚、辛基酚和双酚A含量，从其中的26件样品中检测出了壬基酚的残留。Inoue等[12]也从两种家用的保鲜膜中检测出了壬基酚的存在。另外，近海鱼类受环境激素的污染最为严重，因为海洋及河流中的环境激素不断沉积积累，导致鱼类的体内也不断积累着环境激素[13]。由此可见，食品中的环境激素污染不容小觑，针对其研究高效、快捷、准确的检测技术是当前研究的热点之一[14]。

2 色谱法

2.1 气相色谱(GC)

GC法由于其选择性高、分离效率高、速度快等特点，被广泛应用于食品中有机污染物的检测。但是GC法是一种适用于分离和分析在所有色谱系统中有相当高挥发性物质的方法，低挥发性化合物需要通过硅烷化、酯化、酰化、卤化等衍生化方法变成其衍生物来检测。Cunha等[15]首先用乙腈对罐装水果和蔬菜样品进行萃取、浓缩以及衍生化，并用乙酸进行双酚A(BPA)样品纯化，用GC法定量分析的检测限为3.4 μg/kg。另外，液相微萃取的原位衍生化具有成本效益高、操作方便等优点，也已被GC系统应用于多种极性化合物的分析。如Fiamegos等[16]采用氯甲酸乙酯(ECF)实现对辛基酚和其他烷基酚的原位烷氧羰基化衍生反应，达到对复杂体系酚类环境激素的痕量GC检测的目的。

2.2 高效液相色谱法(HPLC)

HPLC是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，分离效能高、灵敏度高，还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，因此应用范围广泛。Liu等[17]采用均匀设计优化方法，采用固相微萃取-高效液相色谱(SPME-HPLC)法测定双酚A和4-壬基酚(4-NP)，可用于自来水等水样中物质的测定。江洁等[18]采用HPLC 法测定水产品中多种激素残留，结果证明此方法能同时定量检测6种激素，在0.1～10 μg/mL 范围内，这6种激素呈现良好的线性关系；通过回收率、相对标准偏差的评价，此方法对雌二醇、睾酮、甲基睾酮及黄体酮的测定准确性可靠，回收率大于70%，可以应用于实际检测。

总的来说，对食品中环境激素的检测应用中，色谱法优点在于测量的准确性高、分辨率高、重复性好，自动化检测程度高；存在的问题是仪器对样品的前处理包括提取和净化的要求较高，需要昂贵的色谱仪等检测设备，且对操作人员的专业性要求较高。

2.3 色谱质谱联用法

2.3.1 气相色谱/质谱联用法(GC/MS)

GC/MS对于复杂的混合体系具有更好的分离能力和更高的鉴别能力，因此也经常被使用。Vallejo等[19]利用GC/MS 法对水体、鱼胆和鱼肉3种样品中17β-雌二醇(E2)、17α-乙炔基雌二醇(EE2)和雌三醇(E3)，这3种环境激素的检出限分别达到0.04～0.15 ng/L、0.04～0.67 ng/g和0.1～7.5 ng/g。Luo等[20]以氯甲酸甲酯(MCF)为衍生化试剂建立1个对4-NP和辛基酚(OP)进行现场衍生化和萃取的分散式液-液微萃取(DLLME)法，对MCF用量、萃取溶剂、pH、离子强度等关键因素进行了研究，结合GC/MS，将该方法成功地应用于4-NP和OP含量的测定，用该方法得到了4-NP和OP校准曲线，线性范围分别为0.1～1 000 g/L和0.01～100 g/L。Cunha等[21]引入一种新型固相分散吸附剂，然后采用DLLME法进行“原位”乙酰化，再利用GC/MS准确测定不同类型的肉类罐头(香肠、肉制品、肉制品)中痕量BPA和几种相关化合物的含量。

该方法具有快速、准确的优点，性价比高，更容易操作。新型前处理方法有效提高了在复杂基质中提取、分离和富集目标小分子化合物的效率，大大简化了前处理操作步骤。

2.3.2 高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)

HPLC-MS法以高效液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，色谱为混合物的分离提供了最有效的选择，质谱能够提供物质的结构信息。

Xiao等[22]采用HPLC-MS法同时测定了鸡蛋中的包括双酚A及其结构类似物的共8种物质，具有良好的线性、准确度、精密度、检测限，结果表明所提出的分析方法适用于食品中双酚A污染的常规监测，该方法已成功地应用于实际鸡蛋样品的分析。Dong等[23]提出了一种同时测定火锅调味品中6种双酚(双酚A、双酚B、双酚F)和烷基酚(4-壬基酚、4-n-壬基酚、辛基酚)的HPLC-MS法，样品在加入内标双酚A-d4和4-n-壬基酚-d4后分散在己烷中，以甲醇和0.05%氢氧化铵为流动相，在水基萃取柱上梯度洗脱分离出6个目标物，并在多反应监测模式下进行测定，结果表明，待测物检测均在0.1～250 μg/L范围内呈线性关系。

HPLC-MS法分析范围广、分离能力强、测量结果准确，在药物分析、食品分析和环境分析等领域得到了广泛的应用。

3 传感器法

传感器是一种微型化的装置，可以实时、在线传递特定化合物或离子存在的信息，即使是在复杂的样品中。它通常包含两个重要部分——分子识别元件和传感元件。一般原理就是将化学参数(通常是待测物浓度)转换成容易实现转换的信号进行输出。按分子识别元件分类，可以分为免疫传感器、核酸适配体传感器、分子印迹化学传感器等[24]；按照信号转化的形式来分类，电化学传感器、光化学传感器、光电化学传感器等是几种在分析检测中备受关注的类型[25]。

3.1 按分子识别元件分类

分子识别元件的选择和设计对于传感器的性能有着至关重要的作用。近年来，识别元件的选择性和稳定性被给予了更多的关注。在构建传感器的识别元件时，抗体、核酸适配体、分子印迹聚合物(MIPs)等都是较为理想的候选材料[26]。

3.1.1 免疫传感器法

免疫传感器法是以抗体作为识别元件，通过其与小分子抗原的特异性结合来建立定性、定量分析目标物质含量的传感方法。这种免疫传感分析技术具有特异性强、灵敏度高，可以应用于现场样品快速检测等优点，在食品中环境激素的检测中已被有效利用。Zhang等[27]在家兔体内培养邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)特异性多克隆抗体，以该抗体与辣根过氧化物酶(HRP)的偶联物作为检测探针,形成了一种灵敏、特异的检测DEHP的直接竞争酶联免疫分析法。张明翠等[28]设计了一系列实验步骤合成邻苯二甲酸二丁酯人工抗原，再通过免疫兔得到抗体,从而建立了竞争性荧光免疫分析法实现了对邻苯二甲酸二丁酯的测定。庄惠生等[29]建立了测定一系列环境激素雌二醇类(雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和双酚A)的免疫分析新方法，此检测方法灵敏、准确、简单。

以抗体作为识别元件的传感方法具有特异性强的、可对样品进行高通量检测的优势。但是由于环境激素多为小分子，不具有免疫原性，需要与蛋白质偶联合成人工抗原才能通过免疫反应产生抗体。半抗原和人工抗原的设计和合成的难度大、要求高，且人工抗原免疫原活性不高，制备抗体的周期长、步骤复杂、失败风险高；在检测过程中，作为蛋白质大分子的抗体也容易受到检测环境及条件的影响(有机溶剂、较高温度或较高的酸碱环境都会使抗体失活)，从而导致传感器失效，这是免疫传感器法所面临的问题和挑战。

3.1.2 核酸适配体传感器法

核酸适配体是一类对靶分子有特异性识别与结合能力的单链寡核苷酸，可通过指数富集配基的系统进化(SEL-EX)技术获得。与抗体相比，核酸适配体具有相对分子质量小、免疫原性低、体外容易修饰、合成简单、配体多样等优点[30]。刘玉洁等[31]用制备的二硫化钴(CoS2)纳米片与金纳米粒子的复合物修饰玻碳电极，引入17β-雌二醇适配体及其部分互补的富鸟嘌呤的杂交链(c DNA)，以亚甲基蓝(MB)为电化学指示剂实现了对17β-雌二醇的测定(图2)。He等[32]利用抗双酚A适配体和碳化钼(Mo2C)纳米管，研制了一种无标签、低背景的双酚A检测信号DNA传感探针，利用DNA适配体与检测目标物相互作用后改变DNA探针结构，从而引起荧光发生改变产生信号，与传统方法相比，该方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单、无酶、成本低廉等优点，具有潜在的应用价值。Mirzajani等[33]使用双酚A适配体作为探针分子，增强双酚A分子向电极表面的远距离传输的交流电热效应，该传感器在罐头食品样品检测中的成功应用，证明了它在现场跟踪BPA分析中的实用性。

图2 基于核酸适配体荧光DNA传感探针原理[32]

核酸适配体在小分子传感中应用存在的主要问题：一方面不是所有的环境激素分子都有已知的适配体，适配体筛选是一个较大的工程；另一方面，适配体受溶剂、温度等环境影响也较大，稳定性较差。

3.1.3 分子印迹化学传感器法

近些年，分子印迹技术被认为是生产人工识别受体最具潜力的手段，因为受体对目标分子的大小、形状以及官能团都有高度的选择性和专一性[34]。相比于传统的用于分离和检测的介质来说，分子印迹聚合物有更好的理化稳定性、较高的专一识别能力和结构可预测性，合成成本低，应用广泛[35-38]。分子印迹技术的原理简单来说，将所需检测或者是分析的物质作为模板分子，依据目标分析物的结构等特点选择合适的具有优良性能的物质作为单体，在一定条件下，单体和模板分子之间会发生相互作用形成具有特定空间构象的分子印迹聚合物(MIPs)，该分子印迹聚合物通过一定的洗脱方法将模板分子洗脱掉，最后得到的聚合物表面有许多三维孔穴，这样的孔穴与目标分析物官能团的构象和位置等有极大的关系，因此，理论上可用于对目标分析物进行萃取富集，具有高效选择性和专一识别性[39-43]。选择合适的制备方法对于合成具有理想性能的MIPs也是至关重要的。通常，MIPs制备的方法包括沉淀聚合[44]、本体聚合、乳液聚合[45]、固相聚合、表面印迹[46]、溶胶-凝胶过程[47]和电化学聚合[48]。在原位修饰Sn3O4的碳纤维纸上进行电聚合的实验方案见图3，该分子印迹光电化学传感器可以快速特异性检测小分子[48]。分子印迹技术可以实现特异性识别材料的宏量制备，与抗体和适配体这样的生物大分子相比，分子印迹聚合物性质稳定，耐有机溶剂、耐高温，但是检测目标单一，很难实现多目标、高通量的同时检测，并且对于它的工作机制还有待进一步的探索。

图3 在Sn3O4的碳纤维纸上进行电聚合分子印迹的Scheme图及产物表征[48]

3.2 按信号转化形式分类法

3.2.1 电化学传感器法

电化学传感器检测法的工作原理是利用具有电活性的物质与分析物作用，使得待测物浓度的变化快速转化为电化学信号的变化输出，从而计算出待测物的浓度值。这方法不仅简单快速，而且直观明确，在小分子的检测中已有广泛的应用。在识别过程中，电化学传感测量通常产生电流、电位和电荷的等信号变化或是中间介质阻抗变化，这些电信号或数据可以经过进一步处理(包括放大、滤波、分析或显示)，以产生有关分析物的特性及其浓度的信息。与传统分析方法相比，此方法具有操作简单、成本低廉、分析速度快、适用于现场检测等优势[49-52]。

周玲[53]采用电化学还原法和电化学沉积法构建了金纳米粒子/石墨烯复合材料修饰的玻碳电极，构建了基于核酸适配体的电化学传感界面，用于对牛奶中双酚A的检测。分子印迹聚合物作为近年来兴起的识别材料，在环境激素的传感检测中也有相当重要的应用。Des Azevedo等[54]构建了一种基于导电分子印迹聚合物修饰电极的新型电化学传感器用于检测17β-雌二醇(E2)，该传感器以二胺甲基丙烯酰胺(NPEDMA)作为双功能单体，通过电化学聚合，在金电极表面制备了一层薄膜；之后通过N,N-二乙基二硫代氨基甲酸苄酯激活甲基丙烯酰胺基团，光化学接枝在聚苯胺上，在金电极表面形成了一层分子印迹层的，所得到的传感器以循环伏安峰电流为检测信号，检测限为6.86×10-7mol/L。刘松琴课题组的Yu等[55]利用表面分子印迹技术以吡咯作为功能单体、壬基酚为模板分子，通过化学氧化聚合二氧化碳纳米颗粒表面包裹聚吡咯分子印迹聚合物，将制备得到的TiO2/聚吡咯分子印迹纳米复合物修饰在玻碳电极表面，在电化学方法洗脱模板分子后，构建了针对壬基酚的电化学传感器，该传感器可以特异性捕获检测基质中的目标分子壬基酚，并产生相应的电化学信号，该方法检出限为3.91×10-9mol/L，并可以在其他酚类物质(辛基酚、苯酚和双酚A等)中特异性检测壬基酚。

3.2.2 光化学传感器法

荧光传感器法由于其灵敏度高、测量速度快、操作简单，受到了研究者们的关注，未来的潜力不容小觑。目前，人们对荧光传感器的研究热点主要在于设计合成新型的荧光分子和染料，创新荧光传感的原理和机制以及致力于提高传感器的识别特异性和灵敏度。荧光传感器是以荧光光谱法为测量手段，在识别了待测物之后，将这样的结合产生的变化转化为荧光性质的改变而输出，这些性质包括荧光发射峰位置、荧光强度、荧光寿命等。

Xu等[56]以碲化镉(CdTe)量子点作为信号来源，用一锅法合成了具有中孔结构的三聚氰胺分子印迹聚合物，构建了高选择性和高灵敏度的新型荧光传感器，检测限低至38 nmol/L，实现了对牛奶样品中三聚氰胺的检测。Wang等[57]介绍了一种用于测定双酚A的基于诱导剂的荧光检测法，双酚A首先附着在金纳米粒子表面，添加的氮掺杂碳量子点的蓝色荧光会由于聚集态的金纳米粒子引起的内滤效应，从而发生猝灭；加入双酚A后，形成双酚A/核酸适配体复合物，金纳米粒子不再稳定聚集，导致氮掺杂碳量子点的荧光恢复。在10～250或250～900 nmol/L的双酚A浓度范围内，荧光强度和双酚A浓度呈现良好的线性关系，检测限为3.3 nmol/L。基于荧光纳米材料的免疫分析方法也引起了研究者的高度关注，Sheng等[58]提出了一种灵敏的荧光免疫分析法检测饮用水中的双酚A，用上转换发光纳米颗粒作为荧光探针，磁性聚苯乙烯微球(MPM)作为分离组分，水样中双酚A的检测限为0.02 mg/L，该方法分析过程简单快速，具有良好的准确性和实用性(图4)。

图4 双酚A荧光传感器的原理图[58]

3.2.3 光电化学传感器法

化学发光测定以其简单和经济有效的仪器而闻名。该方法具有灵敏度高、线性动态范围宽、重现性好等优点。鲁米诺-高碘酸钾体系是一种优异的化学发光(CL)体系，具有很高的应用潜力。庄惠生等[59]基于BPA对鲁米诺-高碘酸钾化学发光体系的化学发光的抑制作用，建立了双酚A的流动注射化学发光分析法。通过对光电倍增管负高压、泵速、pH、试剂浓度、混合管线长度等条件的优化，使该方法的线性范围为6.0×10-6～1.9×10-3g/L，检测限为1.3× 10-7g/L。用此方法直接测定了饮用水中的BPA，操作快速、准确。陶滔[60]采用Pickering乳液聚合法制备了双酚A分子印迹聚合物，并将其应用于固相微萃取中，对双酚A进行的选择性富集；利用双酚A对Luminol-KIO4-NaOH发光体系的抑制作用，结合流动注射分析技术，对水体中双酚A进行了检测，此方法的线性范围为0.05～1.50 mg/L和1.50～15 mg/L，检测限为17 μg/L。

另外，基于高发光量子点的方法已经引起了科学家的注意，其具有良好的光稳定性、较高的量子效率、较窄的发射光谱和较大的斯托克斯位移吸收光谱等特性，被广泛应用于多种物质的分析。Hassanzadeh等[61]开发了一种高效的氧化锌量子点(ZnO QDs)分子印迹复合材料，用于基于增强化学发光系统的三硝基甲苯选择性检测。ZnO QDs被用作MIP材料的合适载体，3-氨丙基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯在三硝基甲苯的存在下自组装合成MIP。基于三硝基甲苯对分子印迹复合的量子点的化学发光强度具有明显的猝灭作用，化学发光浓度降低，该方法的检测限为6.8 pg/mL。

4 结论与展望

近年来，人们对于环境激素的暴露状况进行了深入的研究，发展了一些相关的前处理和定性定量分析方法。环境激素涉及的样品种类繁多，未来对环境激素的检测和分析，以下几个方面有需要被重点关注：①进一步优化和发展样品预处理技术，对于日渐复杂的环境样品，建立高通量的样品预处理技术，将会显著降低分析检测的成本和时间。②进一步提高检测的选择性，适配体的应用及分子印迹材料都可以进行更深层次的创新。③发展生物技术的应用，检测试剂盒、试纸条或芯片有便捷、灵敏、高效、易用的优势，具有被进一步开发利用的价值。