分子印迹技术用于食品中真菌毒素样品前处理的研究进展

徐 武，付 含，陈贵堂

(中国药科大学 工学院 食品质量与安全教研室，江苏 南京 211198)

近些年来，食品安全越来越受到社会的关注，其中食品中的真菌毒素污染一直是全球关注的热点问题。真菌毒素是由某些丝状真菌在适宜环境中产生的一类具有毒性的小分子次级代谢产物，目前已经鉴定出了400多种真菌毒素，研究发现它们具有强毒性，包括肾毒性、肝毒性、致癌性、免疫抑制性和致突变性[1-2]。它们可以从被真菌毒素污染的坚果、玉米、大米和其他谷物农作物直接进入食物链，也可以通过产毒真菌在食物上生长而间接进入食物链，且大多数真菌毒素具有良好的化学和热稳定性，在加工过程中不易消除，人和动物从食物中摄入微量真菌毒素即可造成急性或慢性中毒。每年因真菌毒素造成的污染引起大规模中毒事件和国际贸易争端极为常见，例如，肯尼亚、印度和马来西亚爆发了严重的黄曲霉毒素中毒，造成数百人死亡；粮农组织(FAO)估计世界约25%粮食作物每年都受到真菌毒素污染，导致数十亿美元的农业和工业损失[3]。为此，世界卫生组织(WHO)、欧盟委员会(EC)和美国食品药物管理局(FDA)已制定了特定的真菌毒素法规，并确定了食品、动物饲料和乳制品中真菌毒素的最大耐受水平[4]。

目前已经开发了色谱法、生物传感技术和酶联免疫吸附法(ELISA)用于检测食品中的真菌毒素，液相色谱(LC)结合质谱(MS)、二极管阵列检测器(DAD)和荧光检测(FLD)是真菌毒素分析的主要手段[5-6]。但是这些分析方法难以检测到痕量真菌毒素，且食品基质中存在许多干扰成分，例如蛋白质、盐、脂质和其他小分子物质，直接进行检测容易引起仪器污染、信号干扰和基质效应等问题，通常需要在仪器分析之前进行大量样品制备和提取[7]。利用分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)制备出的分子印迹聚合物(MIPs)是一种具有出色的特异识别性的合成多孔材料，同时，MIPs还具有易于制备、热稳定性好、机械强度高和使用寿命长等特点，已经广泛应用于固相萃取、色谱科学、化学/生物传感器和酶催化等领域[8-10]。

本文中，笔者对分子印迹技术基本原理进行了概述，介绍了本体聚合、沉淀聚合、悬浮聚合、乳液聚合以及表面分子印迹几种分子印迹聚合物制备方法，叙述了基于分子印迹技术的分散固相萃取、固相微萃取、磁性分子固相萃取、搅拌棒吸附萃取在食品中真菌毒素样品前处理的应用，指出了目前分子印迹技术应用在该领域所存在的不足以及未来的发展趋势，以期为食品中真菌毒素的精准检测提供参考。

1 分子印迹技术的基本原理

分子印迹技术通常被描述为“分子钥匙-人工锁”方法，是一种为获得在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配的聚合物的制备技术，也称分子模板技术[11]。典型的分子印迹聚合物合成原料包含模板、功能单体、交联剂、聚合引发剂和溶剂(致孔剂)，制备基本原理如图1[12]所示。功能单体与模板分子在适当溶剂中通过共价或者非共价作用预聚合形成功能单体-模板分子复合物，然后加入交联剂，在引发剂作用下发生聚合反应，从而获得高度交联的聚合物，最后通过一定方法脱除模板分子，聚合物材料上留下与模板分子形状、大小、官能团和空间排列上互补的三维孔穴结构和结合位点。因此，MIPs可选择性地与模板分子重新结合，即对模板分子具有专一性识别作用[13-15]。

图1 分子印迹技术的基本原理[12]

一个理想的分子印迹聚合物应该具备以下性质：①对诸如pH变化、温度和有机溶剂等恶劣条件具有很高的耐受性，且可反复使用；②制备过程简单，生产成本低；③对目标组分有良好的亲和力、特异性和选择性。

2 分子印迹聚合物的制备方法

2.1 本体聚合法

本体聚合(bulk polymerization)是制备MIPs最普遍和常用的方法，具体操作过程是将模板、功能单体、交联剂和引发剂等按照一定比例混合于非极性溶剂中，在光照或加热条件下进行聚合反应制得棒状或块状的固体聚合物。该方法制备条件容易控制、操作过程相对简单，得到的聚合物表现出较高的选择性和吸附能力[16]。但是在使用前需要进行粉碎、研磨和筛分等费时又费力的处理过程，且聚合物收率低。最重要的是，印迹材料中识别位点包埋过深，难以用有机溶剂洗脱模板分子，这在一定程度上影响了吸附效果。同时，残留的模板分子在使用过程中发生缓慢脱吸，导致MIPs在使用过程中引起假阳性结果[17]。

2.2 沉淀聚合法

沉淀聚合(precipitation polymerization)制备过程和本体聚合相似，但是使用了大量的成孔剂。将模板分子、功能单体、交联剂和引发剂溶解在溶剂中，生成的MIPs不溶于该体系中而析出形成沉淀，然后通过离心或过滤分离，洗涤除去模板分子。通过沉淀聚合得到的MIPs，相比本体聚合法有更为均一的识别位点、较高的表面体积比和吸附性能，该MIPs也常被应用于固相萃取[18]。

2.3 悬浮聚合法

悬浮聚合法(suspension polymerization)的制备方法简便，制备周期短。此法是将模板分子、功能单体、致孔剂和交联剂溶于溶剂中，加入分散剂形成均匀的混合溶液，后加入引发剂在搅拌条件下经升温或光照引发进行聚合，得到高度交联的微球型分子印迹聚合物，最后利用物理方法或化学方法除去模板分子。但是，这种制备工艺常使用水作为分散剂，强极性溶剂干扰模板分子和功能单体的非共价作用，进而影响实际使用过程中的吸附性能[19]。

2.4 乳液聚合法

乳液聚合(emulsion polymerization)是先用有机溶剂溶解模板分子、功能单体和交联剂，然后在水中搅拌该溶液使之乳化，再加入引发剂发生交联聚合反应。这种方法制备的分子印迹聚合物尺寸在纳米级别，且粒子粒径均一、比表面积大。江龙等[20]指出该方法不仅可用于合成结构良好可控的水相容MIPs，克服其他制备方法在水相中特异性识别效果差的缺点，而且可实现目标大分子的有效印迹，进一步拓宽分子印迹技术的应用领域。

2.5 表面分子印迹法

表面分子印迹法(surface polymerization)是近几年新兴的一种方法。表面印迹技术是以适当的纳米材料为载体，如二氧化硅[21]、氧化石墨烯[22]和磁性纳米颗粒[23]等，利用合适的手段如接枝、螯合等在载体表面引入功能单体后,加入模板分子、交联剂和引发剂等发生交联聚合反应，最后得到了表面分子印迹聚合物。这层MIPs在颗粒载体表面含有印迹空穴，提供了更多的吸附位点，不仅具有快速的识别速度和传质速率，而且由于印迹位点都在表面，减少了包埋现象，模板分子更容易洗脱，可解决模板泄露问题[24]。

3 MIPs在真菌毒素样品前处理中的应用

食品和饲料中真菌毒素含量通常极低，在仪器分析之前需要将目标组分富集纯化，因此选择合适的样品前处理技术在分析过程中起着重要作用。液液萃取(LLE)应用广泛，但有机溶剂消耗大，浓缩效率低。免疫亲和柱(IAC)以抗原-抗体特异性为基础，具有非常专一的选择性，但在有机、酸和碱性介质中不稳定，此外，还存在萃取能力有限、吸附剂价格昂贵等问题[25]。固相萃取(SPE)具有回收率和富集系数高、吸附量大、样品处理通量高等优点，且该技术操作简单，易于实现自动化。但是传统固相吸附剂如十八烷基硅烷键合硅胶、石墨化炭黑等存在选择性和特异性差的缺陷，样品制备过程中会造成操作繁琐、耗时且成本高等问题[26]。1994年Sellergren[27]首次将MIPs作为吸附剂从尿液样本中选择性提取正戊脒，从而奠定了分子印迹-固相萃取技术发展的基础。

MIPs用于固相萃取兼具常规SPE和IAC的优点，用于食品样品中真菌毒素前处理可有效预浓缩目标组分，减少仪器分析信号干扰等问题，进而提升分析方法的精密度和准确性，因此近年来受到了广泛应用(表1)。

表1 MIP在常见真菌毒素前处理中的应用

3.1 分子印迹分散固相萃取

分子印迹分散固相取(MI-dSPE)是一种新颖且简单的样品预处理技术，利用MIPs作为固体吸附剂直接添加到分析溶液中，从而促进吸附剂与目标组分直接相互作用。吸附过程完成后，通过机械过程(离心或过滤)将其与样品溶液有效分离。然后，通过使用适当的解吸溶剂进行解吸，达到分离和富集的目的[39]。该方法操作简便，成本低，且有机溶剂的消耗量小。

为了解决模板泄漏、真菌毒素强毒性和材料昂贵等问题，目前相关研究绝大部分采用目标分子的类似物充当虚拟模板来制备MIPs。Liang等[40]以槲皮素为虚拟模板，丙烯酰胺用作共聚单体，采用表面分子印迹法将MIPs接枝到金属有机骨架(MOF)的表面，利用MOF的特殊识别特性、多孔性和可化学修饰的特性制备了新型吸附剂。通过高效液相色谱(HPLC)测定谷物中的黄曲霉毒素(aflatoxin)B1、B2、G1和G2(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)，结果发现，在0.20～45 μg/kg范围内线性良好，LOD为90～130 ng/kg。在质量浓度为20 ng/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、结构类似物香豆素和伊索克酸的复杂混合溶液中，MIPs对黄曲霉素的最大吸附量是其结构类似物的10倍，最大吸附量为11 μg/g，表现出良好的选择性和吸附能力。同时在优化萃取条件下，该吸附剂优于IAC，硅胶SPE和C18 SPE。Munawar等[41]将伏马菌素B1(FB1)接枝到衍生化的玻璃珠上，采用多功能单体策略在玻璃珠表面合成了纳米分子印迹聚合物(MINA)，用60 ℃热水洗脱收集得到高亲和力的MINA，最后通过溶剂蒸发将其沉积到微孔板中对FB1进行选择性吸附，通过酶标仪测量辣根过氧化物酶(HRP)-FB1共轭物和加标玉米提取液(添加显色剂)的吸光度确定FB1的含量。采用IBM SPSS Statistic软件进行数据分析发现，FB1在0.25～0.99 mg/kg范围内，MINA表现出良好的灵敏度，与ELISA和HPLC之间存在良好的相关性；并且MINA对FB1、AFB1、柠檬素等真菌毒素无交叉反应，证明了MINA对FB1的检测具有很高的特异性[30]。由此可见，MINA可作为模仿ELISA中使用的抗体识别元件，用于ELISA和HPLC筛选玉米样品中FB的替代方法。

3.2 分子印迹固相萃取柱法

分子印迹固相萃取柱法(MISPE)是将 MIPs 填装至柱管内进行固相萃取的方法。根据操作方式不同，MISPE 可分为离线型分子印迹固相萃取柱法(off-line MISPE)和在线型分子印迹固相萃取柱法(on-line MISPE)。

离线型分子印迹固相萃取柱法是指样品前处理与分析过程分开独立进行，洗脱溶剂的 pH 和组成等不需要和检测仪器相匹配，因此有利于MISPE吸附及洗脱条件的优化。Zhao等[42]以2-羟吲哚和6-羟基烟酸为双虚拟模板，采用沉淀聚合法成功地制备了展青霉素(PAT)分子印迹聚合物。以该MIPs为吸附剂制备了分子印迹固相萃取柱，优化其装载、洗涤、洗脱等参数进行离线操作，开发了MISPE-LC-MS/MS监测体系用于检测果汁中的PAT。结果发现，在1～100 ng/mL范围内表现出良好的线性，LOD为0.05～0.2 ng/g，LOQ为0.2～0.5 ng/g，在加标回收实验中果汁平均回收率为81.3%～106.3%，RSD<4.5%，使用9个周期后，吸附性能无明显变化。与“QuEChERS”方法相比，该方法对真实样品具有更好的纯化效果和更高的PAT回收率。Rico-Yuste等[43]制作了交替糖(AOH)和交替糖单甲醚(AME)固相萃取柱，使用甲醇/水(两者体积比为25∶ 75)作为溶剂，在70 ℃、6.895 MPa的压力下对番茄样品中AOH和AME进行了加压液体萃取(PLE)，并开发了PLE-MISPE-HPLC-FLD离线方法。将该方法用于强化番茄样品(20～72 μg/kg)中的AOH和AME分析，AOH和AME的LOD分别为7和15 μg/kg，AOH和AME的回收率分别为84%～97%(RSD<8%)和67%～91%(RSD<13%)。Appell等[44]以吡啶甲酸为虚拟模板，结合HPLC-UV用于检测玉米中的镰孢菌酸(FA)，优化了色谱柱上装载、洗涤和回收FA的溶剂，并考察了从功能单体甲基丙烯酸(MAA)和甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)制备的MIPs吸附性能，结果发现，该方法的LOD、LOQ分别为0.5和10 μg/g，加标回收率在83.9%～92.1%，可实现复杂样品中FA定量低水平分析。

在线型分子印迹固相萃取柱法能够同时提取和检测分析物，由于可消除多次转移和清理步骤，缩短前处理时间，减少溶剂消耗的同时提高了重现性，从而提高检测灵敏度并增加了自动化的潜力。Lhotská等[45]通过优化最佳功能单体和致孔剂组合，采用本体聚合法制备了MIPs，建立了MISPE-HPLC-FLD在线检测方法，用于测定红酵母大米、食品补充剂和谷类中的桔青霉素(CIT)，结果发现，LOD为0.6～7.5 μg/L，RSD<2.7%，峰值标准浓度回收率分别为76%、82%和91%，且整个分析时间仅为9.50 min，数百次循环后重现性良好；与传统的C18吸附剂相比，MIP的萃取能力有所提高，更好地减少干扰，可实现食品复杂基质中的桔青霉素的选择性测定。

Yang等[46]用羟吲哚作为虚拟模板，通过溶胶-凝胶聚合在活性二氧化硅珠上制备了一种新型的表面分子印迹聚合物，通过优化了加载样品的pH值，加载流速和洗脱时间，建立了MIPs-SPE-HPLC在线检测PAT的方法。结果显示，富集因子和LOD分别为125和0.5 mg/L，测定了3个加标水平的苹果汁、梨汁、山梨汁和山楂片中的PAT，回收率在60.13%～97.60%，9次重复提取吸附性能无显著变化，这些结果证明了所开发的测定真实样品中PAT方法的适用性和可靠性。

3.3 分子印迹微固相萃取

分子印迹固相微萃取技术(MISPME)是以固相萃取为基础，以多孔聚丙烯中空纤维或其他材料为基体支持物，在其表面涂渍MIPs，通过直接或顶空方式，对待测物进行提取、富集、进样和解析[47]。该技术将采样、萃取、浓缩和进样整合到一个步骤中，并且简单、灵敏度高、省时且易于自动化。

Jayasinghe等[48]以5,7-二甲氧基香豆素(DMC)为假模板分子，采用沉淀聚合法制备了具有均匀粒径分布和完整性的印迹微球，同时使用了超声波辅助提取，多孔膜保护的微固相萃取技术，结合UHPLC-MS开发了一种对鱼饲料中的AFB1、AFB2、AFG1的提取和纯化方法。结果显示，回收率在80%～100%，RSD<20%，LOD为0.42～1.2 g/kg(远低于欧盟委员会)；在吸附实验中，MIPs对DMC和AFs的萃取效率接近100%，对鱼类饲料中存在的其他化合物，例如维生素A和D、β-胡萝卜素等萃取率均低于50%，富集系数为33.3，表现出良好的选择性和吸附能力。并且该萃取装置重复使用20个加载/洗脱循环后性能良好，比市售的一次性设备SPE盒更具有实际优势。

Lee等[49]将制备的MIPs包裹在聚丙烯薄膜中建立了MISPME-HPLC-FLD 检测体系，采用该方法对咖啡、葡萄汁、尿液样品中赭曲霉毒素A(OTA)进行检测，回收率为90.6%～101.5%，LOD分别为0.06、0.02和0.02 ng/mL。该方法与使用商品化IAC具有相似的灵敏度和线性范围，且萃取袋反复使用15次后吸附性能良好。

3.4 磁性分子印迹固相萃取

磁性分子印迹相萃取(m-MISPE)是指在磁性材料表面聚合形成分子印迹层作为吸附剂应用于固相萃取的方法，该方法具有比表面积大、超顺磁性强、专一性好和吸附能力强等特点，作为分散固相萃取的吸附剂，磁性分子印迹聚合物(MMIPs)可以直接分散在样品溶液中，通过外加磁场的作用，使目标分析物快速从基体中分离出来，避免了离心或过滤等实验操作，减少了有机试剂的使用，最终达到分离的效果。

Cavaliere等[50]以槲皮素作为虚拟模板，4-乙烯基吡啶作为功能单体，使用二甲基丙烯酸乙烯酯作为交联剂，邻苯二甲酸二丁酯作为致孔剂，采用表面分子印迹法在Fe3O4纳米颗粒的磁芯表面覆盖了MIP层，结合UHPLC-MS/MS用于谷物粉中玉米赤霉烯酮(ZEN)的测定，结果发现，尽管MMIPs对ZEN和槲皮素结构类似物均表现出交叉选择性，但对于2个较低的加标水平，ZEN回收率均大于95%，LOD为0.14 ng/g，远低于欧洲法律规定的大多数谷物的最高限量。与商用吸附剂相比，更适用于实际复杂样品中痕量ZEA的检测。

Huang等[51]以Fe3O4为磁芯，改性乙烯基埃洛石纳米管上为支撑材料制备了新型磁性表面分子印迹聚合物，以该MIPs作为分散固相萃取的吸附剂对玉米样品中的ZEN进行了纯化和富集。在静态和动态吸附实验中，MMIPs在相同浓度下吸附容量明显高于MNIPs和碳纳米管(HNTs)，最大吸附量接近于7 mg/g，且达到吸附平衡只需要5 min，远优于传统MIPs。在选择性吸附实验中，MMIP对ZEN和其结构类似物大黄酚印迹因子(IF)分别为2.97和0.98，表现出对ZEN良好的结合力。同时，HPLC显示，该方法的线性范围为10～200 ng/mL,LOD和LOQ分别为2.5和8 ng/mL，加标回收率为74.95%～88.41%，RSD<4.25%。在100 s内通过外磁场快速地进行分离，成功地应用于玉米、燕麦和小麦样品的处理。

笔者所在团队的Fu等[52]在国家重点研发计划(2018YFC1602801)的资助下，近来的工作中制备了2种磁性分子印迹聚合物作为固相萃取材料，选择性地萃取展青霉素和玉米赤霉烯酮，结合高效液色谱建立了2种对实际样品中真菌毒素检测的方法。加样回收实验研究结果表明这些方法的RSD值均低于5%，回收率高于80%，制备的磁性分子印迹聚合物具有良好的磁性，可以快速地从复杂样品环境中分离。通过吸附性能实验发现，制备的印迹材料吸附容量大并可以快速地达到吸附平衡，且材料具有良好的重复使用能力。但是仍然存在着洗脱时间较长，自动化程度低，难以用于商业化等缺点，需要在后续的研究中重点解决。

3.5 分子印迹搅拌棒吸附萃取

分子印迹搅拌棒吸附萃取(MI-SBSE)是从MISPME衍生而来，具有与MISPME相似的提取机制，MI-SBSE是将覆盖有MIP涂层涂覆在搅拌棒的表面，萃取过程基于目标分析物在固定相和样品之间的分配平衡。该方法具有富集因子高、重现性好、吸附能力强和无溶剂等优点。

Díaz-Bao等[53]在本体聚合体系中直接添加Fe3O4粒子后进行聚合，成功地将MIPs嵌入到磁性纳米Fe3O4中，开发了一种快速简便的制备磁性分子印迹搅拌棒(MMIP-SBSE)的方法，结合HPLC-MS，直接用于萃取婴儿配方奶粉中和谷物类婴儿加标溶液中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2，结果发现，它们的平均回收率分别为60%、43%、40%、44%和39%，RSD低于10%，表明了该方法具有良好的提取性能以及识别能力。Regal等[54]以PAT结构类似物2-吲哚酮作为假模板分子，采用典型的接枝工艺，将分子印迹聚合物接枝到玻璃搅拌棒的硅烷化表面，与HPLC-MS/MS联用测定棒曲霉素，结果发现LOD和LOQ分别为10、50 ng/g，在搅拌和最短装载时间45 min条件下，PAT的回收率为60%～70%，同时，搅拌棒聚合物涂层在使用数小时后，吸附能力无显著变化。

4 结论与展望

近年来，分子印迹相关文献呈现指数型增长，充分说明分子印迹技术已经取得了极大的发展。

为了让分子印迹技术更好地应用于食品中真菌毒素样品前处理，未来的研究可能会集中在以下领域：①探索MIP合成策略和识别机制，找到新的的功能单体、交联剂和引发剂，解决洗脱过程繁琐问题。②利用计算机软件功能单体-模板相互作用进行模拟，快速筛选合适功能单体,从而缩短开发时间并加快合成过程。③开发亲水性MIPs和绿色合成路线，减少有机溶剂的使用。④开发具有多种检测模式分子印迹传感器，精确测定一种或多种真菌毒素，满足对大量样品进行快速现场筛查的要求。