TGF-β1对兔激素性股骨头缺血坏死治疗的实验研究

吴成玉，许克庆，葛迅，马帅，陈小虎，汤义民，金璐，陶钧

(1.安徽理工大学医学院；2.安徽理工大学第一附属医院暨安徽省淮南市第一人民医院骨科，安徽 淮南 232001)

激素性股骨头缺血性坏死(steroid induced avascular necrosis of the fomoral head，SANFH)的病因是长期或大剂量的应用糖皮质激素致使股骨头骨组织代谢失衡、血供受损或中断从而导致局部缺血坏死，关节面塌陷，甚至骨折[1]。由于糖皮质激素在临床上的用处广泛，使得激素性股骨头缺血性坏死成为骨科的多发病和常见病之一[2]。目前关于激素性股骨头缺血性坏死的发病机制的认识存在争议，主要考虑与脂质代谢紊乱学说[3-4]、血管内凝血学说[5]、骨质疏松学说[6]、细胞自噬学说[7-8]等有关。因此关于SANFH的治疗也未有统一意见，虽然临床上非手术治疗和手术治疗均有一定进展，但疗效仍差强人意。故而关于激素性股骨头缺血性的治疗急需一种疗效确切的治疗方法。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)在骨损伤的修复中起重要作用，既可促进成骨细胞分化[9],又在成骨细胞向受损区域的迁移中发挥重要作用[10]。同时，TGF-β1亦可抑制破骨细胞的成熟和破骨细胞前体的增殖[11]。虽然TGF-β1的骨修复作用已被广泛认可，但关于TGF-β1对激素性股骨头坏死的疗效及作用机制却鲜有研究和报道。本研究通过建立激素性兔股骨头坏死模型，应用TGF-β1进行治疗，观察实验动物中脂质及空骨陷窝的变化、股骨头组影像学改变，探讨TGF-β1对激素性股骨头坏死的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年新西兰大白兔44只，体重为(2.25 ± 0.25)kg，均为雄性，单笼喂养。动物购买自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物许可证编号：SCXK(苏)2017-0011，由蚌埠医学院动物实验中心提供并在此完成实验。

1.2 药物及试剂

药物：TGF-β1，25微克/支，购于PeproTech，生产批号：0218209-1 H1318；甲泼尼龙，500毫克/瓶，购于Pfizer Manufacturing Belgium NV，进口药品注册标准 H2017199；大肠杆菌内毒素(lipopolysaccharide,LPS),10毫克/支，购于Sigma-Aldrich,生产批号 028M4094V；青霉素钠，80万单位/支，购于中诺药业有限公司，国药准字H13021634。

1.3 分组

44只新西兰大白兔行生化分析检查血总胆固醇和甘油三酯，结果不具有统计学意义(P>0.05)。适应性饲养1 w后随机分成3组：治疗组(18只)，模型组(18只)，空白对照组(8只)。

1.4 造模和干预方法

1.4.1 造模 模型组、治疗组经耳缘静脉注射LPS，剂量10 μg/kg，每天1次，共注射2次，每次注射间隔24 h。最后一次注射LPS后，间隔24 h，肌肉注射甲泼尼龙，剂量为 25 mg/kg，每天1次，连续注射3次，每次注射间隔24 h。运用此种方法复制激素性股骨头坏死。对照组新西兰大白兔分别于上述时间点行耳缘静脉注射和肌肉注射生理盐水。

1.4.2 给药 对照组正常喂养；模型组给药后正常喂养；治疗组在注射LPS后即肌注TGF-β1，剂量为0.5 μg/kg,连续6 w。每组均予以肌注青霉素，剂量为20万单位/只，2次/周。

1.5 主要设备和仪器

1800全自动生化分析仪：Siemens；光学显微镜：Olympus；电子计算机X射线断层扫描机：GE Revolution。

1.6 血清脂质生化检查

分别在第3、7周末时间节点，各组均在兔右侧耳缘静脉采血，并使用全自动生化分析仪测定各组动物的总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)的血清水平。

1.7 CT检查

在第7周末，各组均用空气栓塞法处死新西兰大白兔，并取出双侧股骨头。CT影像成像在淮南市第一人民医院影像科完成，使用电子计算机X射线断层扫描机进行双侧股骨头断层扫描成像。

1.8 股骨头形态学检查

在第7周末，各组均用空气栓塞法处死新西兰大白兔，取出双侧股骨头。放入10%福尔马林溶液中固定脱钙，浸蜡包埋，制成切片并行HE染色。光镜下观察各组骨小梁、骨细胞的变化，计数空骨陷窝并计算空骨陷窝率。

1.9 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，各组间采用单因素方差分析，再进行两两比较(LSD)，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 第3周末和第7周末时各组的血清脂质检测结果

各组间单因素方差分析显著性水平均小于0.01。与对照组相比，其余两组在第3周末时TC、TG均出现明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；第7周末时，与模型组相比，治疗组的TC、TG降低，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 各组血脂指标的比较

2.2 各组兔股骨头HE染色观察结果

7周末对照组：骨小梁结构完整，排列整齐，空骨陷窝少见，未见大量脂肪细胞增生和嗜酸性粒细胞聚集，见图1A；7周末模型组：骨小梁明显变细且间有断裂，走形差，空骨陷窝增多，部分陷窝内骨细胞消失，可见脂肪堆积及大量的嗜酸性粒细胞聚集，见图1B；7周末治疗组：骨小梁变细且走形和结构稍差，空骨陷窝较多，可见少量嗜酸性粒细胞和脂肪细胞增生，见图1C。各组不同时间点空骨陷窝率的比较，见图2。

图1 第7周时各组股骨头 HE 染色结果(× 100)

注：与对照组相比，aP<0.05；与对照组相比较，bP>0.05

2.3 CT检查结果

7周对照组：检查可见双侧股骨头表面平滑，外形完整，股骨头内部未见明显异常改变，见图3A；7周模型组：检查可双侧股骨头表面不光滑，股骨头塌陷，外形不规则，股骨头内部出现囊性改变并有低密度区域，见图3B；7周治疗组：可见双侧股骨头表面稍不平滑，未见股骨头塌陷，股骨头内部无明显异常信号，见图3C。

图3 第7周时各组股骨头CT结果

3 讨 论

由于激素在临床的广泛的应用，SANFH的发病率日益增加[12]，且该病好发于中青年(20～50岁)男性，这对个人和家庭的各个方面有着很大的不良影响。近年来，关于激素性股骨头坏死机制的研究有很多，学者们也提出了多种假说，这些假说虽然可以从某个角度解释激素性股骨头坏死的病理机制，但又无法完全解释激素性股骨头坏死的病理演化过程。因而如何有效的预防和治疗激素性股骨头坏死仍是一个亟待解决的问题。TGF-β1是庞大的TGF-β家族的一员，是骨细胞中最丰富的细胞因子[13]，在骨形成和骨修复中起着重要作用[14-17]。TGF-β1不仅能够多个通路促进前成骨细胞的分化和增殖，还可抑制成熟破骨细胞和破骨细胞前体的增殖[18-19]。另外，TGF-β1对人成骨细胞具有显著的趋化作这种效应在低浓度的TGF-β1时特别明显[20-21]。因而TGF-β1对股骨头坏死的修复重建有着至关重要的作用。有研究表明SANFH患者体内的TC、TG水平均显著高于正常水平，统计学分析表明，TC是导致股骨头坏死的独立危险因素[22-23]，这个发现与脂质代谢紊乱学说不谋而合。本实验中，模型复制后的模型组兔的TC、TG显著高于对照组，且治疗组TC和TG的水平显著低于模型组。这说明TGF-β1可以改善血脂升高的现象，其他学者的研究发现也证明了这一观点[24-25]。这可能也是TGF-β1治疗股骨头坏死的途径之一。此外，激素性股骨头坏死部位的血运情况差，往往会因局部缺血导致骨细胞凋亡。TGF-β1是促进血管内皮细胞增殖和血管形成的活性因子之一，在机体损伤修复和血管重建的过程中扮演重要角色[26-27]。在本研究中治疗组兔股骨头HE染色的光镜检查结果优于模型组也可能与此有关。

综上所述，肌注TGF-β1治疗激素性股骨头坏死疗效显著，作用机制可能与促进成骨细胞的分化和增殖，抑制成熟破骨细胞增殖，降低血脂和重建血管改善股骨头坏死部位的血液循环有关。