槲皮素对低钙高镁饮食大鼠血清矿量和骨代谢的改善作用

邓静 张景岚 周广朋 钟莉

四川省人民医院，四川 成都 610072

骨质疏松症是一种多种因素(如绝经、矿物质代谢异常、骨代谢异常等)引起的骨密度、骨质量下降性疾病[1]。骨质疏松症患者临床主要表现为疼痛、脊柱变形、易骨折等，疼痛可降低患者生活质量，脊柱变形可使患者活动受限，易骨折可导致患者致残，不仅给患者生活质量带来影响，而且也给社会、家庭和个人带来严重的经济负担[2]。当前，骨质疏松发病机制研究主要集中于矿物质代谢异常方面，钙摄入量不足容易导致骨质疏松症，即低钙骨质疏松症[3]。镁元素摄入量与骨质疏松症发病的关系研究还存在争论，但较多研究认为镁元素摄入量过高会导致骨质疏松症发生，同时临床也有研究证实低钙高镁饮用水的钙镁元素交互作用也是骨质疏松症发生的重要原因[4-5]。槲皮素是具有雌激素拮抗剂活性的雌激素类物质，其雌激素拮抗剂活性包括抗菌、抗肿瘤、抗病毒等[6]。近年来，临床研究发现槲皮素也具有增加成骨细胞分化活性和抑制破骨细胞骨吸收的药理作用，在维持骨代谢稳定方面可发挥功效[7]。然而槲皮素应用于钙镁元素交互作用骨质疏松临床防治的研究未见报道，鉴于此，本研究以动物实验方式观察槲皮素对低钙高镁饮食大鼠血清矿量和骨代谢水平的影响，为骨质疏松临床防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：雄性SD成年黑色大鼠(供货商：中科院生物学研究所；质量合格证号：SCXK(京)2017-0034；动物伦理审查证号：SP-DW-SMP-09-015-01)60只，鼠龄为2～4个月，平均月龄(2.08±0.24)月，体重300～330 g，平均体重(317.23±10.14) g。

1.1.2实验药物：槲皮素：购自上海研生实业有限公司，药品批文：CS-0020-0807，药品规格：50 mL/瓶，槲皮素含量200 μg/mL。

1.2 实验方法

1.2.1适应性喂养及动物分组：动物置于符合中国实验动物质量国家级清洁标准的实验室中饲养，温度设定在20 ℃～25 ℃，湿度为40%～70%，饲料为颗粒饲料(SCXK黑2018-008)，饮用水为灭菌水。均适应性喂养2周后，随机分为空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组，每组各20只。

1.2.2低钙高镁饮食骨质疏松造模：适应性喂养2周后，模型对照组和槲皮素喂养组均进行低钙高镁(钙5 mg/L，镁60 g/L的蒸馏水溶液，由硫酸钙、硫酸镁、蒸馏水按比例配置)喂养3个月，参考《中国老年骨质疏松诊疗指南(2018)》[8]行大鼠第2腰椎QCT骨密度绝对值检测，以骨密度绝对值<80 mg/cm3为骨质疏松造模成功标准。

1.2.3实验喂养方法：空白对照组实验期间正常喂养。模型对照组造模成功后正常喂养3个月。槲皮素喂养组造模期间给予槲皮素股动脉注射，给药剂量按体重比计算槲皮素给药量，雄性SD成年黑色大鼠体重取40只大鼠的平均体重317.23 g，成人标准给药量为1000 μg/(kg·d)[9]，成人体重取值120 kg，计算可得成年大鼠的槲皮素标准给药量为2.64 μg/(kg·d)。

1.3 观察指标

1.3.1一般情况观察：记录整个实验期间大鼠的日常饮食量、饮水量、体重、毛发、毛发色泽、活动等情况。

1.3.2血清矿量及骨代谢指标。分别于低钙高镁喂养前(实验前)和给药喂养3个月时(实验后)两个时刻点采集大鼠耳根静脉血0.2 mL进行血清矿量及骨代谢指标测定。包括血清矿量(血钙、血镁、血磷)、骨吸收相关指标[Ⅰ型胶原联蛋白羧基末端肽(CTX1)、I型胶原氨基酸延长肽(tPINP)]、骨形成相关指标[骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(BGP)]。检测方法：作4 000 r/min的离心处理10 min后，取上清-60 ℃保存。然后采用ELISA法测定BALP、CTX-1、tPINP的表达水平(试剂盒购自武汉博士德公司)，采用放射免疫法测定BGP水平(试剂盒购自美国Roche Diagnostic公司)，采用化学发光法测定血钙、血镁、血磷含量，检测过程中严格按照各检测项目试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况比较

实验期间，空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组大鼠无死亡。空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组大鼠的日常饮食量、饮水量、体重等一般行为均无显著变化，且模型对照组和槲皮素喂养组大鼠的日常饮食量、饮水量、体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。实验后，空白对照组、槲皮素喂养组大鼠活动灵敏有力，毛发光润(图1 A、1B)，模型对照组大鼠反应较为迟钝，毛发稍显暗淡(图1C)。

表1 各组大鼠实验前后一般情况比较

图1 实验大鼠毛发色泽、毛质观察 A：槲皮素喂养组；B：空白对照组；C：模型对照组Fig.1 Observation on hair color and quality of experimental rats. A: Quercetin feeding group; B: Blank control group; C: Model control group

2.2 血清矿量情况

空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组大鼠实验前的血清矿量(血钙、血镁、血磷)比较，差异无显著性(P>0.05)。模型对照组大鼠实验后的血钙量、血磷量下降，血镁量提升，与实验前比较，差异具有显著性(P<0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的血钙量、血磷量、血镁量与实验前比较，差异无显著性(P>0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的血钙量、血磷量均显著高于模型对照组大鼠实验后，槲皮素喂养组大鼠实验后的血镁量均显著低于模型对照组大鼠实验后，差异具有显著性(P<0.05)。详见表2。

2.3 骨形成指标情况

空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组大鼠实验前的骨形成指标(BALP、BGP)比较，差异无显著性(P>0.05)。模型对照组大鼠实验后的BALP下降，BGP提升，与实验前比较，差异具有显著性(P<0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的骨形成指标(BALP、BGP)与实验前比较，差异无显著性(P>0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的BALP显著高于模型对照组大鼠实验后，槲皮素喂养组大鼠实验后的BGP均显著低于模型对照组大鼠实验后，差异具有显著性(P<0.05)。详见表3。

表2 各组大鼠实验前后血清矿量比较

表3 各组大鼠实验前后骨形成指标比较

2.4 骨吸收指标情况

空白对照组、模型对照组和槲皮素喂养组大鼠实验前的骨吸收指标(CTX1、tPINP)比较，差异无显著性(P>0.05)。模型对照组大鼠实验后的骨吸收指标(CTX1、tPINP)均提升，与实验前比较，差异具有显著性(P<0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的骨吸收指标(CTX1、tPINP)与实验前比较，差异无显著性(P>0.05)。槲皮素喂养组大鼠实验后的骨吸收指标(CTX1、tPINP)显著低于模型对照组大鼠实验后，差异具有显著性(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠实验前后骨吸收指标比较

3 讨论

据估计，我国骨质疏松症人群高达1亿人以上，占比已经达总人口的7%以上，且占比呈逐年增长的趋势，同时随着人口老龄化，骨质疏松症发病越来越多，使骨质疏松症防治成为当代医学的研究热点[10]。骨质疏松症发生的根本原因在于骨吸收和骨形成功能失衡。目前学术界普遍认为骨质疏松症发病机制包括4个方面：雌激素分泌异常、骨钙缺乏、系统性骨激素调控异常和遗传受体异常，其中骨钙缺乏是骨质疏松症发生的最主要原因[11]。临床大剂量补充钙元素可导致机体软骨组织严重钙化，临床有补充镁元素替代补充钙元素治疗骨质疏松症，且证实确有实效，这引发了镁元素与骨质疏松症发生的关系方面研究的开端[12]。镁元素可通过荷尔蒙及其他调节因子间接对机体骨组织代谢产生影响，可促进机体骨形成，有研究显示无论补钙多少，若不联合补充镁元素，仍会产生骨质疏松症[13]。我国学者谭瑶[14]和外国学者Lucia等[15]均报道了本地区低钙高镁饮用水使本地区骨质疏松症发病率高于其他地区，可见镁、钙元素的交互作用可提升骨质疏松症的发病率。本研究以低钙高镁饮食建立了钙镁交互作用骨质疏松症大鼠模型，从模型构建结果来看，大鼠骨密度值达到了低于80 mg/cm3的要求，同时模型对照组大鼠实验后的血钙量、血磷量、BALP均下降，血镁量、BGP、CTX1、tPINP均提升，与实验前比较差异显著(P<0.05)。可见模型构建较为成功，且也证实了钙镁交互作用可诱导骨质疏松症发生。

本研究观察了槲皮素对低钙高镁饮食骨质疏松症大鼠的生长、血清矿量、骨代谢水平的影响。SD大鼠一般于出生10周龄(2.5个月左右)后性器官发育成熟，3个月后骨骼发育成熟，在此期间SD大鼠可进入成年期，成年期SD大鼠生长发育受遗传和环境因素影响较小，因此可采取营养补给方式对大鼠生长进行干预[16]。本研究采用雄性SD成年大鼠进行研究，可避免遗传和环境因素对生长发育的影响。本研究显示，与适应性喂养期间比较，实验期间模型对照组和槲皮素喂养组大鼠的日常饮食量、饮水量、体重等一般行为均无显著变化，且模型对照组和槲皮素喂养组大鼠的日常饮食量、饮水量、体重比较无差异性，虽然槲皮素喂养组实验大鼠更具活力，毛发更光润，但可以认为槲皮素对低钙高镁饮食大鼠的生长基本无影响。血钙、血镁、血磷均是与机体骨代谢相关的重要矿物质，可在骨质疏松症发生发展中起到重要作用。本研究结果显示，槲皮素喂养组大鼠实验后的血钙量、血磷量均显著高于模型对照组大鼠实验后，槲皮素喂养组大鼠实验后的血镁量均显著低于模型对照组大鼠实验后，提示槲皮素对低钙高镁饮食大鼠异常血清矿量有改善作用。血钙、血镁、血磷等形成的血清矿物质调节系统是一个互相联系、互相制约的整体，当血钙、血磷含量下降和血镁含量上升时，会导致机体甲状旁腺激素分泌增加，促进1α-醇化酶活性和25(OH)2D3的合成[17]。25(OH)2D3不但可抑制骨代谢相关钙结合蛋白生成，而且会抑制骨代谢水平[18]。结合本研究槲皮素对低钙高镁饮食大鼠异常血清矿量的改善作用，提示槲皮素可起到防治骨质疏松症的作用。在骨质疏松症发生过程中，骨代谢水平的作用明显，其中主要起作用包括骨吸收相关指标、骨形成相关指标等，但具体作用机制当前并无确切定论。王华林等[19]认为骨形成指标BALP和BGP可反映成骨细胞成熟度和物理活性，是骨形成功能的表型标志物，BALP下调或BGP上调均可导致骨质疏松症的发生。Akatau等[20]认为骨吸收指标CTX-1、tPINP上调均可导致骨密度下降，最终引发骨质疏松症。在本研究中，槲皮素喂养组大鼠实验后的血钙量、血磷量、BALP均显著高于模型对照组大鼠实验后(P<0.05)，但与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；槲皮素喂养组大鼠实验后的血镁量、BGP、CTX1、tPINP均显著低于模型对照组大鼠实验后(P<0.05)。研究结果提示槲皮素可对低钙高镁饮食大鼠异常骨代谢水平有改善作用，可能原因在于槲皮素具有增加成骨细胞分化活性和可抑制破骨细胞骨吸收的功效，使槲皮素喂养组大鼠的骨吸收和骨形成保持动态平衡[21-22]。结合槲皮素对低钙高镁饮食大鼠异常骨代谢的改善作用，提示槲皮素可起到预防骨质疏松症的作用。

综上所述，镁、钙元素的交互作用可诱导骨质疏松症发生，槲皮素可显著改善低钙高镁饮食大鼠血清矿量和骨代谢水平，可能在低钙高镁交互作用诱导骨质疏松症的预防中起到重要作用。但本研究仅为动物实验，将槲皮素应用于骨质疏松症临床预防，仍需要前瞻性研究的证实。