动物双歧杆菌NMC对小鼠溃疡性结肠炎的预防作用

姜岩世，张永祥，刘利平，刘力，王鹏杰，王然

（1.西藏高原之宝牦牛乳业股份有限公司，拉萨 610000；2.三河福成生物科技有限公司，廊坊 065201；3.中国农业大学营养与健康系，北京 100083）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis）是一种非特异性炎症性肠病，临床上主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便[1]，具有难治性且极容易复发，并存在癌变风险，故被世界卫生组织列为现代难治病之一[2]。UC发病机制尚不明确，与肠道通透性增加、炎症反应、免疫和肠道菌群紊乱等多种因素相关[3]。

益生菌能够降低肠道通透性、调节肠道菌群和免疫系统，因此，对UC具有潜在的治疗效果[4]。研究表明，双歧杆菌三联活菌可以通过影响紧密连接蛋白的表达和分布来增强肠道屏障的完整性，防止病原菌和化学物质对其破坏[5]。婴儿双歧杆菌能够增加肠道上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1和occludin的表达，从而增强上皮细胞的屏障功能，并改善IL-10敲除小鼠的结肠炎症状[6]。益生菌的代谢产物，如短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、抗菌活性肽等，可以有效减少肠内有毒物质氨和胺的产生，同时抑制外毒素的生成，减少肠道致病菌对肠道的伤害，维持肠道菌群的正常平衡，达到预防和减轻UC发病的效果[7]。

本研究以分离自西藏牦牛乳的动物双歧杆菌NMC为研究对象，体外评价其耐酸耐胆盐能力，并利用DSS诱导Balb/C雄性小鼠构建UC模型，探讨其对UC的预防能力，为相关益生菌产品的开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 菌株

动物双歧杆菌NMC，中国微生物菌种保藏中心保藏，CGMCC No.12944。

1.1.2 材料

葡聚糖硫酸钠（DSS），美国MP Biomedicals公司；酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）试剂盒，美国Ebioscience公司；anti-ZO-1、anti-Occludin、anti-E-cadherin，美国Abcam公司；兔抗鼠酶标二抗，中国Beyotime公司；8周龄SPF级Balb/C野生型雄性小鼠，购买于北京维通利华试验动物技术有限公司；维持饲料购买于北京华阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 仪器

CKX-41型光学显微镜，日本奥林巴斯公司；Milli-Q Biocel型超纯水系统，美国MilliPore公司；PB3002-N型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；石蜡切片机，德国Leica公司。

1.2 试验方法

1.2.1 耐酸、耐胆盐测定[8]

将菌株以1%接种量接种传代并进行厌氧培养，每代培养12h，在第二代培养12h后，将菌液在4 500r/min条件下离心10min，把菌体分别重悬于pH3（盐酸调节pH）的MRSC培养基和胆盐浓度为0.3%的MRSC培养基中，在0、1、2、3、4h时测其活菌数，并计算存活率（存活率=最终活菌数/初始活菌数）。

1.2.2 急性溃疡性结肠炎动物模型的建立[9]

8周龄SPF级Balb/C野生型雄性小鼠50只，适应性喂养1周后，小鼠随机分为5组，每组10只，分别为对照组、模型组、菌低剂量组（NMCL组）、菌中剂量组（NMCM组）、菌高剂量组（NMCH组）。对照组在整个试验期间灌胃生理盐水；试验前7d，模型组灌胃生理盐水，各菌剂量组分别灌胃0.2mL不同浓度的菌液，小鼠每天的灌胃剂量分别为5×108CFU/kg、5×109CFU/kg和5×1010CFU/kg；从第8天开始，除对照组外，各组在灌胃同时自由饮用2.5% DSS溶液，为期7d，造成试验性结肠炎模型，造模期间每日观察小鼠的一般状况、体质量、大便性状和隐血情况。

1.2.3 小鼠结肠炎疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分

造模过程中观察并记录小鼠体重变化、粪便性状及大便隐血/肉眼血便情况，并按表1进行DAI综合评分[10]。

表1 DAI评分标准

1.2.4 结肠长度测量

试验14d结束后脱颈处死小鼠，取出肛门至盲肠末端的整个肠断，观察结肠的外观形态，并测量长度。

1.2.5 结肠组织病理分析

取结肠远端炎症反应明显处约1cm的结肠组织，于10%的甲醛中固定72h后，用乙醇作脱水剂除去组织中的水分，于二甲苯中透明后用石蜡包埋，固定于切片机上切成薄片，进行苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色。以盲法观察肠黏膜损伤情况，并进行组织学损伤评分。

1.2.6 结肠组织炎症因子检测

利用ELISA法测定小鼠结肠组织中的促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，试验操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.7 数据统计

采用SPSS 21.0单因素方差分析进行统计学分析，计数资料数据以平均值±标准差（±s）表示，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 耐酸、耐胆盐评价

双歧杆菌等益生菌必须具有强的耐高胃酸和耐高胆盐的能力，才能活着到达肠道发挥益生作用。研究表明，胃液的pH值为3左右，十二指肠的胆盐浓度为0.3g/kg左右[11,12]，本试验以pH值为3（盐酸调节pH）和胆盐浓度为0.3%模拟人体肠道环境，研究动物双歧杆菌NMC对胃酸和胆盐的耐受能力。如图1所示，在pH 3.0条件下培养1～4h，动物双歧杆菌NMC活菌数发生下降，培养4h与0h相比活菌数下降一个数量级，下降幅度较小，证明该菌株对胃酸具有良好的耐受性。在0.3%的胆盐浓度下培养1～4h，在前3h内活菌数变化不大，第4h，活菌数发生显著下降，与0h相比活菌数下降2数量级，下降幅度较小，证明该菌株对胆盐具有良好的耐受性。

图1 动物双歧杆菌NMC对酸和胆盐的耐受性

2.2 结肠炎疾病活动指数

试验结束后对小鼠进行DAI综合评分，结果如表2所示，模型组小鼠DAI评分最高，为8.81±2.25，显著高于对照组（P＜0.05），表明小鼠造模成功；经动物双歧杆菌NMC处理后，各组小鼠的DAI评分有不同程度降低，低、中、高剂量组分别为6.56±1.35、4.37±0.95、3.89±0.99，各剂量组DAI分数均显著低于模型组（P＜0.05），表明动物双歧杆菌NMC对UC具有一定的预防作用。

2.3 小鼠结肠情况及长度的变化

图2 各组小鼠结肠长度

本试验结束后解剖小鼠，对照组小鼠结肠组织完好、肠腔内粪便成形；模型组结肠肠腔内可见不成形暗红色血便；动物双歧杆菌NMC各组小鼠肠腔内出血减少，粪便基本成形。对照组小鼠结肠长度最长，为11.2±0.8cm，模型组最短，为7.8±0.6cm，NMC低、中、高剂量组分别为8.7±0.5cm、9.5±0.7cm和10.9±0.5cm，与模型组相比，均有显著增加，其中高剂量组结肠长度与对照组相比没有显著差异（图2），表明动物双歧杆菌对溃疡性结肠炎导致的小鼠结肠长度的缩短有抑制作用，并呈剂量依赖性。

2.4 小鼠结肠组织病理学炎症评分

UC的病变多累及直肠和远端结肠，结肠黏膜出现弥漫性炎性细胞浸润和多发性溃疡[13]。小鼠结肠组织病理切片HE染色如图3所示，对照组小鼠的结肠黏膜结构完整，杯状细胞正常，隐窝正常，腺体排列整齐，未见黏膜溃烂，无炎性细胞的浸润，其组织病理学炎症评分为0；模型组小鼠结肠黏膜组织损伤明显，黏膜严重缺损、出血、腺体紊乱、隐窝破坏，炎症细胞浸润严重，深度达整个黏膜层，组织病理学炎症评分为9.8±1.5，表明造模成功；动物双歧杆菌NMC处理后，结肠黏膜损伤减轻，腺体、隐窝破坏减轻，炎性细胞浸润减轻，低、中、高剂量组评分分别为6.5±1.1、4.8±0.9和4.2±0.5，显著低于模型组（表2），表明该菌能够预防小鼠结肠组织损伤，并具有剂量依赖性。

图3 小鼠结肠组织HE切片

表2 各组小鼠DAI评分及结肠组织病理评分

2.5 小鼠结肠组织炎症因子的变化

受损的肠黏膜上浸润的大量炎性细胞可分泌炎症因子，进而对肠黏膜造成损伤，放大炎症反应[14]。本研究利用ELISA法测定了小鼠血清中的炎症因子水平，结果如图4所示。与对照组相比，模型组中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量显著升高（P＜0.05），表明UC可导致小鼠血清中促炎因子的表达量升高；与模型组相比，经动物双歧杆菌NMC干预后，低、中、高剂量组促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表达量显著下降，并呈剂量依赖性，表明动物双歧杆菌NMC能够抑制促炎因子的表达，降低肠上皮细胞的损伤，进而预防UC的发生和发展。

图4 各组小鼠血清中促炎因子的表达

3 结论

本研究探讨了动物双歧杆菌NMC的耐酸耐胆盐能力及预防UC的作用。结果表明，动物双歧杆菌NMC在pH3.0，0.3%胆盐浓度环境下具有良好的耐受性。在利用DSS诱导小鼠建立UC模型时，动物双歧杆菌NMC可显著降低UC小鼠DAI评分，缓解结肠长度缩短，缓解结肠黏膜损伤和炎症细胞浸润，降低结肠组织病理评分，降低促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表达，从而预防UC的发生和发展。