眼络通方对兔视网膜静脉阻塞模型促血管新生因子PDGF、VEGF表达的影响

冯燕兵 熊烈 石彦波 曾子善 沈志新 翁文庆

1.嘉兴市中医医院 浙江，嘉兴 314000 2.温州医科大学附属温岭医院

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion，RVO）是一种常见的危害视功能的视网膜血管疾病，据研究估计目前世界上大约有1 600万成年人发生RVO[1]。RVO的发病机制尚未完全阐明，由于视网膜新生血管形成是影响患者视力预后的主要原因，因此目前研究热点集中在针对血管新生的治疗[2]。祖国传统医学对RVO的治疗以活血化瘀为基本治法[3]，银杏叶提取物天保宁片，具有活血化瘀通络、扩张血管、改善微循环的作用，而且不良反应轻微，临床上广泛用于RVO的治疗[4]，能够促进视网膜出血吸收，改善患者视力，对视网膜新生血管的形成可能有一定的抑制作用，但对病情重的RVO患者疗效欠佳。眼络通方由葛根、川芎、地龙、三棱、水蛭5味中药组成，全方共奏活血化瘀、破血消积之效，临床实践及研究已经证实其有效性[5-6]。研究证实，由眼络通方衍生的逍络方在RVO继发的黄斑水肿治疗中也具有较好的临床疗效[7]。但眼络通方的作用靶点、分子机制等仍不完全清楚，因此深入探讨眼络通方干预RVO发展的作用机制具有重要意义。前期研究发现，血小板源性生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）在兔RVO模型血管内皮细胞中呈高表达[8]，而且PDGF与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 在RVO发生发展中起重要作用[9]。基于以上研究基础，本研究拟进一步探讨眼络通方对RVO动物模型视网膜血管新生的影响，为临床应用眼络通方治疗RVO提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 普通级雄性新西兰兔48只（共96眼），体质量1.5～2.0kg，眼前节、眼底检查无异常，购于桐乡市银海兔业专业合作社［实验动物生产许可证号：SCXK （浙）2013-0056、SCXK （浙）2018-0002］，饲养于嘉兴学院实验动物中心［实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2014-0017］。饲养条件：温度20～25℃，湿度40%～70%，光照12h明暗交替。适应性饲养1周后，将动物随机分为2组：空白对照组12只和模型组36只。

1.2 实验材料与仪器设备 眼络通颗粒由葛根颗粒20g、川芎颗粒10g、地龙颗粒10g、三棱颗粒10g、水蛭颗粒3g组成，由嘉兴市中医医院药剂科提供，颗粒剂加开水溶解，充分搅拌后放置数分钟；天保宁片购于博普-益普生工业公司 （规格：40mg×30片，批号：H2003122），使用时研成粉末，温开水溶解；复方托吡卡胺滴眼液由山东博士伦福瑞达制药有限公司生产（规格：0.4mL/支，批号：H20023089），一般滴1～2次，每次以1滴为剂量；20%乌拉坦由嘉兴学院医学院提供；逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量试剂盒购于TaKaRa公司（批号：RR036、RR091）；VEGF一抗、PDGF一抗购于abcam公司（ab1316、ab194504）；辣根过氧化物酶标记二抗购于上海碧云天生物技术有限公司（批号：A0216）；7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品。

1.3 RVO模型的建立 参照孙红等[10]采用的激光造模方法建立RVO模型：模型组新西兰兔以复方托吡卡胺滴眼液点眼散瞳1～2次，充分扩瞳，耳缘静脉注射20%乌拉坦5mg·kg-1全身麻醉，先拍摄眼底彩色照相，角膜表面麻醉后放置三面镜，以氩离子激光封闭视网膜视乳头两侧髓翼血管系的主干静脉 （光凝斑直径200～250μm，功率600～800MW，时间0.3～0.5s）。造模过程中使激光准确聚焦主干静脉，不伤及邻近动脉，光凝封闭的静脉段长度约1瞳距 （pupil distance，PD），直至被封闭静脉变细发白，血流停滞，远端迂曲扩张，再由远端向近端光凝照射。激光光凝封闭视网膜静脉24h后，行眼底彩色照相及眼底血管造影（fundus fluorescein angiography，FFA）观察血管闭塞情况，验证造模是否成功。若闭塞不完全则补充光凝封闭，封闭视网膜静脉后再行FFA证实静脉已被阻塞，血流中断。

1.4 动物实验给药与取样 将模型组新西兰兔随机分为模型对照组、天保宁组和眼络通组，每组各12只。术后24h各组开始灌胃给药，参照体质量剂量换算方法[11]，将临床给药剂量换算为实际给药量，空白对照组及模型对照组给予0.9%氯化钠溶液5mL/（kg·d）灌胃，天保宁组以天保宁水溶液0.02g/（kg·d）灌胃，眼络通组以眼络通水溶液6.9g/（kg·d）灌胃。各组灌胃均为1次/d，连续给药4周，分别于灌胃给药的第1、2、4周，各组选取4只新西兰兔处死，并及时摘除眼球，一眼去除角膜、晶状体及玻璃体制成眼杯，10%中性甲醛保存，用于后续免疫组化实验；一眼分离完整视网膜组织，于液氮中快速冷冻后转至-80℃冰箱保存，用于Western blot与实时荧光定量PCR （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）实验。

1.5 视网膜组织病理学观察 选择空白对照组与模型对照组新西兰兔，分离视网膜组织，按染色要求处理后，石蜡包埋，4μm连续切片备用。常规脱蜡后，进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色。200倍及400倍镜下观察视网膜组织的病理学改变。

1.6 免疫组化检测视网膜组织PDGF、VEGF表达 各组新西兰兔视网膜组织按要求处理后，石蜡包埋，4μm连续切片备用。采用链霉亲和素-生物素复合物（streptavidin-biotin complex，SABC）法染色，石蜡切片微波修复处理，常规脱蜡至水，消除内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后分别滴加血清封闭液、一抗和二抗，蒸馏水冲洗后行辣根过氧化物酶二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）显色剂显色，苏木素复染，脱水、透明后封片。400倍镜下观察，以细胞质中见到棕黄色颗粒为阳性。

1.7 Western blot检测视网膜组织PDGF、VEGF表达 各组新西兰兔视网膜组织按要求处理后，加入放射免疫沉淀反应试验 （radio-immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液，充分震荡裂解后，离心取上清液即为总蛋白提取液。二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）法蛋白定量后，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），转膜后依次进行一抗、二抗孵育，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）显影，凝胶成像仪拍摄，并进行灰度分析。

1.8 RT-PCR检测视网膜组织PDGF、VEGF mRNA表达 各组新西兰兔视网膜按要求处理后，Trizol法提取总RNA，测定浓度后，将总RNA逆转录为cDNA，并以此为模板进行后续实验。引物于生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1，反应条件见表2。采用△△Ct法计算各mRNA的相对表达量，倍增变化率=2-△△Ct（△△Ct=各实验组△Ct-空白对照组△Ct，△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.9 统计学分析 应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料行正态检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Tamhane's T2法检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组新西兰兔视网膜组织病理改变比较 光镜下观察，空白对照组新西兰兔视网膜各层次（如神经节细胞层、内外核层等）结构清晰整齐，视网膜血管位于视网膜表面，视网膜颗粒层细胞排列紧密。见图1A。

RVO造模后，新西兰兔视网膜层次（如神经纤维层、神经节细胞层等）紊乱，内层视网膜静脉可见水肿，管壁增厚、受损，出现神经节细胞层、纤维层空泡。见图1B。

2.2 各组新西兰兔视网膜组织PDGF和VEGF免疫组化染色比较 空白对照组新西兰兔视网膜组织中PDGF主要分布在神经节细胞层、神经纤维层及内外丛状层，可见细胞质微量淡黄色颗粒状染色。见图2A。RVO造模后，新西兰兔视网膜组织中PDGF表达于血管内皮细胞、神经节细胞层及内外丛状层，染色强度和密度明显增强，呈棕黄色。见图2B。天保宁给药后，新西兰兔视网膜组织PDGF免疫组化染色强度与密度与模型对照组比较未见减少，故PDGF表达较空白对照组仍显著增加。见图2C。眼络通给药后，视网膜组织（内丛状层、神经节细胞层）中可见淡黄色颗粒状染色，PDGF表达较模型对照组中明显减少，但染色仍较空白对照组更深。见图2D。

空白对照组新西兰兔视网膜组织中VEGF主要分布在神经节细胞、神经纤维层，内外丛状层，可见细胞质微量淡黄色颗粒状染色，血管内皮细胞几乎不着色。见图2E。RVO造模后，新西兰兔视网膜组织中VEGF表达于光感受细胞层、内外丛状层、内核层及神经节细胞层，染色强度和密度增强明显，呈棕黄色。见图2F。天保宁给药后，视网膜组织VEGF表达较空白对照组仍显著增加，与模型对照组比较未见减少。见图2G。眼络通给药后，VEGF表达较模型对照组明显减少，但仍高于空白对照组，视网膜组织（内丛状层、内核层及神经节细胞层）中仍可见淡黄色颗粒状染色。见图2H。

图1 各组视网膜组织病理改变Fig.1 Pathological changes of retinal tissue in each group

图2 免疫组化检测各组视网膜组织PDGF、VEGF蛋白表达（400×）Fig.2 Immunohistochemical detection of PDGF and VEGF protein expression of retinal tissue in each group（400×）

2.3 各组新西兰兔视网膜组织PDGF和VEGF蛋白表达比较 与空白对照组比较，模型对照组1、2、4周PDGF和VEGF蛋白表达量均增高（P＜0.05）；与模型对照组比较，眼络通组1、2、4周PDGF和VEGF蛋白表达量显著降低（均P＜0.05），但仍均显著高于空白对照组（P＜0.05），而天保宁组1、2、4周PDGF和VEGF蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与天保宁组比较，眼络通组1、2、4周PDGF和VEGF蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。见图3、表3。

图3 各组视网膜组织PDGF和VEGF蛋白表达比较Fig.3 Comparison of PDGF and VEGF protein expression of retinal tissue in each group

表3 各组视网膜组织PDGF和VEGF灰度比较Tab.3 Comparison of PDGF and VEGF gray levels of retinal tissue in each group

2.4 各组新西兰兔视网膜组织PDGF和VEGF mRNA表达比较 与空白对照组同时相比较，模型对照组1、2、4周VEGF和PDGF mRNA相对表达量均增高 （P＜0.05），以第2周最为显著，PDGF分别上调约840%、2 700%、1 040%，VEGF分别上调约860%、1 530%、990%。与模型对照组同时相比较，眼络通组1、2、4周PDGF和VEGF mRNA相对表达量均降低 （P＜0.05），PDGF分别下调约60%、90%、70%，VEGF分别下调约70%、80%、70%，且第2周高峰消失，但仍均显著高于空白对照组 （P＜0.05），而天保宁组1、2、4周PDGF和VEGF mRNA相对表达量与模型对照组同时相比较差异无统计学意义（P＞0.05），第2周仍存在高峰。与天保宁组比较，眼络通组1、2、4周PDGF和VEGF mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05）。见图4。

3 讨论

图4 各组视网膜组织PDGF和VEGF mRNA表达比较Fig.4 Comparison of PDGF and VEGF mRNA expression of retinal tissue in each group

近年来研究表明，RVO引起视网膜组织缺血缺氧，破坏血管生长促进因子和抑制因子的平衡，诱导新生血管形成，导致玻璃体积血、新生血管性青光眼等严重危害视力的并发症[10]。VEGF和PDGF在新生血管形成中发挥着重要作用[12]。研究发现，VEGF和PDGF在眼内视网膜组织中皆有表达，但两者表达量均处于较低的水平[13-14]。RVO导致视网膜组织血流量降低，引起缺血缺氧状态，诱导VEGF和PDGF过量表达，是引起一系列并发症的关键因素之一。因此，抑制VEGF和PDGF的表达是治疗眼内血管新生的重要策略之一[15]。Hou等[16]研究发现，在脉络膜新生血管性疾病（choroidal neovascularization，CNV）模型中，激光治疗后玻璃体腔单次注射PDGF-CC中和抗体2μg能够在不同时间段减少脉络膜新生血管病变区域，表现出与VEGF中和抗体相似的抗血管生成作用。

RVO属于中医学“暴盲”范畴，与肝肾心脾等脏腑、气血等关系密切，其病因复杂多样。但不论RVO由何种诱因引起，其客观结果皆为瘀血形成，瘀血阻滞脉络，则血不循经，溢于络外，以致出血、瘀血而发病，因此治疗以活血化瘀为基本治法。中医药治疗RVO疗效良好，更容易被患者接受，具有广阔的应用前景。彭清华等[3]应用中药散血明目片干预RVO兔模型，发现散血明目片能促进RVO后出血的吸收，改善视网膜组织缺血缺氧的状态，抑制VEGF在视网膜面的高表达。

本研究中所用眼络通方由葛根、川芎、地龙、三棱、水蛭5味中药组成，川芎上行头目直达病所；地龙活血通络，兼利水消肿；三棱、水蛭均能破血消积，为峻猛之品；葛根有升清作用。川芎、地龙活血化瘀为主药，水蛭、三棱破血消积为辅，佐以生葛根升清降浊，全方共奏活血化瘀、破血消积之效。药理试验表明，葛根、地龙、三棱等有扩张血管、抗凝、溶栓和抗炎等作用：葛根的有效成分葛根素可降低血管反应性，改善视网膜微循环，下调PDGF表达水平[17]；地龙能够抑制血小板聚集，增强红细胞膜稳定性[18]；川芎能促进红细胞、血小板的解聚，增强纤溶活性，降低纤维蛋白稳定因子活性，可抑制血栓的发生发展[19]。既往研究发现，眼络通方可通过改善微循环，改善局部缺血状态，抑制毛细血管通透性，减轻巨噬细胞吞噬功能，加快炎性物质吸收，对RVO的治疗起到积极作用[5-6]。

本研究建立了RVO新西兰兔模型，免疫组化检测可见空白对照组视网膜组织中神经节细胞、神经纤维层、内外丛状层中均有少量VEGF和PDGF表达，但视网膜组织中VEGF和PDGF mRNA及蛋白表达量均较少。RVO模型建立后，视网膜组织中VEGF和PDGF mRNA及蛋白表达量均较空白对照组显著增加，天保宁治疗后PDGF和VEGF mRNA及蛋白表达量有所下降，但与模型对照组比较差异无统计学意义。既往研究证实，银杏叶片提取物天保宁的有效成分可以改善微循环，并能清除自由基、抗氧化、抗血小板凝集，改善血液高凝状态，保护视网膜细胞[20]。还有研究发现天保宁对VEGF分泌有影响[21-22]，但尚无针对RVO的具体研究。赵晋晋等[23]研究证实天保宁对PDGF-BB有调节作用，但对PDGF其他家族成员无明显调节作用。本研究发现天保宁对VEGF和PDGF表达无显著抑制作用，笔者考虑天保宁治疗RVO的主要机制可能不是调节PDGF和VEGF表达，可能还存在其他信号通路的参与。眼络通方治疗后，各时间点PDGF和VEGF mRNA及蛋白表达量均较模型对照组显著降低，且第2周的表达高峰消失。由此笔者推测，眼络通方能通过抑制VEGF和PDGF的表达，在一定程度上抑制新生血管形成，从而改善RVO患者的视力预后。

综上所述，本研究证实眼络通方具有抑制新生血管形成的作用，其作用机制可能与下调VEGF和PDGF在视网膜组织中的表达有关，但更详细的分子机制尚需进一步深入研究加以证实。