白术多指标成分含量测定方法优化

王丽敏 周燕红 杨莹 杜伟锋 葛卫红 李昌煜

1.杭州市中医院 杭州 310007 2.浙江中医药大学 3.浙江中医药大学中药饮片有限公司

白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功效，主治脾虚食少、腹胀泄泻等病症，应用十分广泛，主产于浙江、安徽、河北、湖南、湖北等地[1]。白术自古具有“北参南术”“十方九术”等美誉，是常规的大宗药材之一，年需求量在万吨以上。但是作为如此常规的药材，2015版《中国药典》一部中白术项下却无含量测定项，无法突显白术的内在质量，因此难以保障其相关制剂的质量[2]。目前关于白术质量标准最完善的是《香港中药材标准》[3]，其中有白术的含量检测项，但是没有形成统一规范。虽然现在也已经有很多以多个成分同步测定或利用液相指纹图谱来控制白术质量的相关报道[4-7]，但方法不统一，也未能建立统一可行的标准，而且现有的含量测定方法只能测定白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或苍术酮单个指标或两三个指标，不能同时简单有效地测定4个指标成分。因此本研究对白术含量测定方法进行优化，以期建立一种简单、高效、准确可行的白术多指标含量检测方法，为后续白术含量标准的建立及其质量控制研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器 U3000高效液相色谱仪购于日本Dionex公司，配置包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样器、恒温柱温箱、二极管阵列检测器（diode array detection，DAD）、变色龙色谱数据工作站；NT-xs105电子分析天平 （精度：0.01mg）、ME-204E电子分析天平（精度：0.01g）均购于瑞士Mettler Toledo公司；BWS-1-SN电子天平（精度：±0.1g）购于厦门佰伦斯电子科技有限公司；DFD-700电热恒温水浴锅为天津泰斯特仪器有限公司产品；KQ-500DB数控超声波清洗器购于昆山超声仪器有限公司。

1.2 药物和试剂 白术药材产自浙江磐安新渥镇，经杭州市中医院主管中药师周燕红鉴定为白术（A-tractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根茎。白术内酯Ⅰ（纯度99.9%）、白术内酯Ⅱ（纯度99.9%）、白术内酯Ⅲ（纯度99.9%）均购于中国食品药品检定研究院（批号：111975-201501、111975-201501、111975-201501）；苍术酮（纯度98%）购自成都瑞芬思生物科技有限公司（批号：C-084-20）；甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、磷酸均为分析纯，均购于广东广华科技股份有限公司（批号：20190605、20190320、20190511、20190613、20190710）；液相用甲醇、乙腈为色谱纯，均购于美国Tedia试剂有限公司 （批号：19065701、19055061）；水为娃哈哈纯净水。

1.3 供试品溶液制备方法考察

1.3.1 不同提取方法考察 （1）超声提取离心法：精密称取白术粉末1.0g，过标准3号筛，置于50mL离心管中，加70%乙醇10mL，密塞后称重，超声处理20min，冷却后以70%乙醇补足失重，4 000r/min离心5min，过滤后取上清液，剩余残渣粉末再加70%乙醇10mL，按上述过程离心2次，合并两次滤液，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。（2）超声提取浓缩法：精密称取白术粉末1.0g，过标准3号筛，置于150mL锥形瓶中，加70%乙醇50mL，密塞后称重，超声处理20min，冷却后以70%乙醇补足失重，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置于蒸发皿中，浓缩至小体积，以70%乙醇转移至5mL容量瓶中，定容后摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。（3）回流提取法：精密称取白术粉末1.0g，过标准3号筛，置150mL锥形瓶中，加70%乙醇50mL，密塞后静置30min，称重，85℃水浴回流2h，冷却后以70%乙醇补足失重，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25mL，置于蒸发皿中，浓缩至小体积，以70%乙醇转移至5mL容量瓶中，定容后摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。3种提取方法分别重复6次，比较3种不同提取方法的误差。

1.3.2 提取溶剂考察 （1）不同有机溶剂：以1.3.1项下超声提取离心法制备供试品溶液，70%乙醇分别换成甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷4种不同有机溶剂，比较4种不同有机溶剂的提取效果。（2）乙醇浓度考察：以1.3.1项下超声提取离心法制备供试品溶液，70%乙醇溶剂分别换成80%乙醇、95%乙醇和无水乙醇3种不同浓度，比较4种不同浓度乙醇的提取效果。（3）溶剂用量考察：以1.3.1项下超声提取离心法制备供试品溶液，以无水乙醇为提取溶剂，溶剂量分别为5、10、20、30mL，比较不同溶剂量对提取效果的影响。

1.3.3 超声时间和次数考察 以1.3.1项下超声提取离心法制备供试品溶液，70%乙醇溶剂换成无水乙醇，超声时间分别为10、20、30min，超声次数分别为1、2、3次，比较9种不同参数下超声提取的效果。

1.4 高效液相色谱-二极管阵列检测器（high-performance liquid chromatography-diode array detection，HPLC-DAD）测定4种指标成分含量

1.4.1 水分测定 参照《中国药典》通则中水分测定方法中第二法测定[8]。

1.4.2 对照品溶液配制 精密称取白术内酯Ⅰ对照品5.20mg置于5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，溶解摇匀，得白术内酯Ⅰ对照品储备液；精密称取白术内酯Ⅱ对照品4.93mg置于5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，溶解摇匀，得白术内酯Ⅱ对照品储备液；精密称取白术内酯Ⅲ对照品4.94mg置于5mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，溶解摇匀，得白术内酯Ⅲ对照品储备液；精密称取苍术酮对照品4.50mg置于10mL容量瓶中，加无水乙醇至刻度，溶解摇匀，得苍术酮对照品储备液。分别取0.1mL的白术内酯Ⅱ、Ⅲ，苍术酮对照品储备液和0.2mL白术内酯Ⅰ对照品储备液混匀，得白术内酯Ⅰ溶液浓度为0.4160mg·mL-1、白术内酯Ⅱ溶液浓度为0.1972mg·mL-1、白术内酯Ⅲ溶液浓度为0.1976mg·mL-1、苍术酮溶液浓度为0.0900mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.4.3 色谱条件 采用HPLC-DAD测定白术中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮四个指标成分。色谱条件：流动相为0.1%磷酸（A）和乙腈（B）；流速：1.0mL·min-1；进样量为10μL；色谱柱采用ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6mm×250mm 5-Micron；柱温25℃。梯度洗脱程序：0～8min，60% B；8～16min，60% B～75% B；16～20min，75% B～100% B；20～30min，100% B；白术内酯Ⅰ检测波长（λ=276nm），白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮检测波长（λ=220nm），理论板数不低于2 000。

1.4.4 HPLC方法学考察

1.4.4.1 精密度考察 精密称取同一批次白术样品，按照1.3.1项下超声提取离心法制备，以无水乙醇作为溶剂，按照1.4.3项下色谱条件进样，连续进样6次，记录各峰面积（mAU×min），计算6次进样峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.4.4.2 稳定性考察 精密称取同一批次白术样品，按照1.3.1项下超声提取离心法制备，以无水乙醇作为溶剂，按照1.4.3项下色谱条件进样，分别在0、2、4、8、12、24h各进样一次，记录各峰面积（mAU×min），计算6次进样峰面积的RSD值。

1.4.4.3 重复性考察 精密称取同一批次白术样品6份，按照1.3.1项下超声提取离心法制备，以无水乙醇作为溶剂，按照1.4.3项下色谱条件进样，记录各峰面积（mAU×min），计算含量及其RSD值。

1.4.4.4 线性方程考察 精密移取白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对照品储备液，以乙醇逐级稀释成不同浓度梯度的混合对照品溶液，按照上述色谱条件进样，以浓度为横坐标（x，单位mg·mL-1），以峰面积为纵坐标（y，单位mAU×min），绘制标准曲线，得回归方程。

1.4.4.5 加样回收考察 精密称取同一批次白术样品6份，按照1.3.1项下超声提取离心法制备，以无水乙醇作为溶剂，取1mL供试品，进样测定后，加入一定量的白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮对照品储备液，按照1.4.3项下色谱条件进样，记录各峰面积（mAU×min），分别计算样品和加样后含量，以及加样回收率和RSD值。

1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白术药材水分含量测定结果 该批白术药材的水分含量测定结果为9.97%。

2.2 供试品溶液制备方法考察结果

2.2.1 不同提取方法考察结果 《香港中药材标准》中白术含量测定以70%乙醇作为提取溶剂[3]，因此本研究不同提取方法考察均以70%乙醇为溶剂。按照1.4.3项下色谱条件，3种不同提取方法对4个指标成分测定结果比较可知，超声提取离心法的测定结果最好，各成分的测定含量最高，且RSD最小，最为稳定；回流提取法测定结果最差，各成分的测定含量最低，回流提取效果欠佳，且RSD均大于5.00%，稳定性不佳。见表1。说明超声提取离心法提取效果最好，且稳定性好，因此选用该方法作为白术供试样品制备方法。

2.2.2 提取溶剂考察结果

2.2.2.1 不同溶剂考察结果 甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷4种不同极性的有机溶剂液相色谱图见图1。从图1中可以看出，乙酸乙酯的溶剂峰最大，其他化合物回应值不明显；甲醇的图谱溶剂峰较高，而且甲醇、无水乙醇、正己烷3种溶剂图谱分离的化合物数都差不多，保留时间也相对一致；无水乙醇和正己烷的图谱效果最好，其中正己烷的溶剂峰最小，但是在20min后无水乙醇分离的小分子化合物较正己烷多，且分离度较好，而且无水乙醇更不易挥发，更为稳定，因此选用无水乙醇作为溶剂最佳。4种溶剂的极性大小为甲醇＞无水乙醇＞乙酸乙酯＞正己烷，上述分离效果说明溶剂的极性对白术化学成分的分离效果无显著影响。

表1 三种方法4个指标成分测定结果（n=6）Tab.1 Determination results of 4 index components by three methods(n=6)

图1 不同溶剂选择结果Fig.1 Results of different solvents selection

2.2.2.2 不同乙醇浓度考察结果 依据《香港中药材标准》[3]，白术含量检测以70%乙醇为溶剂，因此本研究选择乙醇为溶剂，进一步考察不同的乙醇浓度对白术化学成分的提取分离效果。70%乙醇的溶剂峰响应峰高为830mAU，80%乙醇为550mAU，95%乙醇为175mAU，无水乙醇为60mAU。不同浓度乙醇对色谱图的溶剂峰影响十分显著，以无水乙醇的溶剂峰最小，70%乙醇溶剂峰最大；而且除溶剂峰外，其他各峰的分离和回应值差异无统计学意义（P＞0.05），因此选择无水乙醇为最佳溶剂。见图2。

2.2.2.3 不同溶剂用量考察结果 不同溶剂用量条件下各指标成分的峰面积和含量结果见表2。单因素方差分析发现，相同加样量、不同溶剂量组间各指标的含量差异均无统计学意义（P＞0.05），说明不同溶剂量对提取效果无明显影响。但是溶剂量越大，成分稀释比例增大，峰面积回应值越小，因此综合峰面积回应值和后续超声次数，选择加样量1.0g、溶剂量10mL为含量测定的物料比。

图2 不同乙醇浓度选择结果Fig.2 Results of different ethanol concentrations selection

表2 不同溶剂量对白术指标成分含量的影响（n=3）Tab.2 Effect of different solvents on the index components content of Atractylodes Macrocephala Rhizoma(n=3)

2.2.3 不同超声时间和次数考察结果 不同超声时间和次数对白术4个指标成分峰面积和含量影响的结果如表3所示。结果显示，超声1次的情况下，20min和30min超声提取时间各指标含量均高于10min，差异有统计学意义（P＜0.01），说明在超声1次的情况下，超声时间越长，提取的效果越好。超声时间选择10min和20min时，超声次数越多，提取效果越好，超声3次的各指标含量均高于1次和2次，差异有统计学意义（P＜0.05）。但是当超声时间过长和超声次数过多时，超声时间和超声次数对各指标成分含量无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05），甚至有超声次数过多，其提取效果越差的现象。因此采用短时多次超声的方法，能够在确保白术内在成分稳定的同时，将其提取效果最大化，综合比较以超声3次，每次10min提取效果最佳，峰面积回应值也高。

2.3 HPLC-DAD方法学考察结果

2.3.1 白术样品和对照品HPLC结果 白术样品和对照品色谱图见图3，A1、B1分别为白术药材和白术对照品220nm吸收波长下吸收光谱，A2、B2分别为白术药材和白术对照品在276nm吸收波长下吸收光谱。

表3 不同超声时间和次数对白术指标成分含量的影响（n=3）Tab.3 Effect of different ultrasound time and frequency on the content of Atractylodes macrocephala Rhizoma(n=3)

2.3.2 精密度考察结果 计算得出，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮RSD值分别为1.45%、1.30%、1.32%、2.10%，均小于2.50%，4个成分的峰面积及RSD见表4。说明该测定方法的精密度良好。

2.3.3 稳定性考察结果 计算得出，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮RSD值分别为1.72%、1.50%、1.67%、2.31%，均小于2.50%，4个成分的峰面积及RSD见表5。说明该测定方法的稳定性良好。

2.3.4 重复性考察结果 计算得出，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和苍术酮RSD值分别为1.66%、2.36%、1.94%、2.34%，均小于2.50%。见表6。说明该测定方法的稳定性良好。

2.3.5 线性方程考察结果 白术内酯Ⅰ在0.0015～0.1915mg·mL-1的浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=563.02x-0.2152（r2=0.9999），白术内酯Ⅱ在0.0085～0.1350mg·mL-1的浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=502.87x+0.2092（r2=0.9999），白术内酯Ⅲ在0.0015～0.3565mg·mL-1的浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=299.79x-0.08（r2=0.9998），苍术酮在0.0145～0.9005mg·mL-1的浓度范围内线性拟合的标准曲线回归方程为y=46.568x-0.1396（r2=0.9999）。见表7。说明该测定方法线性关系良好。

图3 白术药材样品和对照品HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of Atractylodes macrocephala Rhizoma samples and reference substance

2.3.6 加样回收率考察结果 各成分回收率RSD值分别为2.26%、3.29%、3.69%、2.14%，加样回收率均在95%～105%区间内，且RSD均小于4.00%，说明该方法的加样回收率符合要求。见表8。

2.4 方法验证 综合上述结果，以HPLC-DAD法检测白术4个指标成分准确稳定可行，同时通过对不同提取方法考察，选择超声离心法制备供试样品；考察不同溶剂、超声时间和超声次数等因素对提取效果的影响，选择白术粉末1.0g，无水乙醇10mL，超声3次、每次10min，为白术最佳样品制备条件。取白术样品6份，经优化方法提取后，按照1.4.3项下色谱条件测定进行方法的验证，得到的结果见表9。

3 讨论

现今HPLC已成为测定中药内在化学成分的最常规和最重要的方法，但是影响其准确性和精度的因素诸多，从供试样品的制备到色谱条件的每个环节都将影响其测定结果。本研究主要侧重于白术含量测定方法中样品制备这一过程，结合前期进行的色谱条件考察，在水-甲醇、水-乙腈、0.1%磷酸水-甲醇和0.1%磷酸-乙腈4种流动相下，选择0.1%磷酸水-乙腈作为流动相，峰形和分离度相对最佳；4种不同流速0.5、0.8、1.0和1.5mL·min-1中，以1.0mL·min-1流速最佳；进样量选择10μL；色谱柱选择ZORBAX Eclipse XDB-C18 Analytical 4.6mm×250mm 5-Micron。梯度洗脱程序为0～8min，60% B；8～16min，60% B ～75% B；16～20min，75% B～100% B；20～30min，100% B。比较20、25、30和40℃不同柱温，确定以25℃最佳，基线平稳。通过全波长扫描，确定白术内酯Ⅰ在276nm吸收波长处有最大吸收峰，白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术酮在220nm吸收波长处有最大吸收峰，该液相方法经方法学考察验证准确、稳定可行。

表4 HPLC方法精密度考察结果Tab.4 Results of precision investigation of HPLC method

表5 HPLC方法稳定性考察结果Tab.5 Results of stability investigation of HPLC method

表6 HPLC方法重复性考察结果Tab.6 Results of repeatability investigation of HPLC method

表7 HPLC方法线性考察结果Tab.7 Results of linear investigation of HPLC method

表8 HPLC方法加样回收考察结果Tab.8 Results of sample recovery of HPLC method

表9 白术提取方法验证结果Tab.9 Verification results of Atractylodes macrocephala Rhizoma extraction method

在供试样品制备的提取过程中发现，超声时间超过30min，苍术酮的含量随超声次数增多反而降低。同时也有研究报道超声时间越长，产热量高，提取溶剂温度上升明显，高温将影响白术内在化学成分的稳定性[9-10]。说明苍术酮的温度敏感性高，在长时间超声的高温状态下苍术酮分解转化成别的成分，所以导致超声时间超过30min后，其含量反而降低。

因为白术质量标准缺少含量测定项，这将影响白术的内在质量，因此本研究从白术供试样品的制备方法考察，结合HPLC-DAD确定白术多指标成分测定的方法，同时测定白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术酮4种成分，为白术的含量测定质量标准的建立奠定前期研究基础，从而进一步完善白术药典质量标准，提升白术药材的质量。