汕头市妇女HPV-52感染与宫颈鳞状上皮病变的关系

王媛媛，陈依超，郑 洁，彭燕燕，王少洪

(1．汕头市中心医院病理科，广东 汕头515041；2．汕头市中心医院临床医学研究中心，广东 汕头 515041；3．汕头市中心医院检验科，广东 汕头 515041)

据2018年全球癌症数据统计显示，子宫颈癌发病率占恶性肿瘤发病率的6.6%，死亡率居第4位[1]。根据我国国家癌症中心发布的2015年全国癌症数据统计结果显示：恶性肿瘤中子宫颈癌新发病例数居第6位，占比6.04%，死亡率居第8位，占比3.61%[2]。众所周知，持续性的人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是子宫颈癌发生的首要和必要条件，HPV检测及宫颈薄层液基细胞学筛查(thinlayer liquid-based cytology test，LCT)有助于发现早期病变[3-4]。本课题前期研究发现：在汕头市宫颈病变筛查人群中，单一感染及多重感染最常见的亚型是HPV-52[5]，但HPV-52感染在该地区的致病特点，目前尚未见文献报道。本研究立足于汕头市人群，分析HPV-52感染在宫颈鳞状上皮病变中的发病风险，拟为研制针对这一特定人群HPV感染疫苗提供理论依据，并为该市HPV-52感染人群提供诊断、治疗及预防的参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析汕头市中心医院2015年1月1日—2018年7月31日期间门诊、体检及住院患者同时进行HPV检查及LCT检查者37 700例作为研究对象。研究对象中去除LCT检查不满意标本，同时排除有宫颈鳞状细胞和腺细胞异常4例及188例腺细胞异常标本，只针对子宫颈鳞状细胞学异常进行相关统计。患者为汕头本市人群，按照美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南，对其中3 924例进行了宫颈活检。本研究经过汕头市中心医院伦理委员会批准。

1.2 宫颈HPV及LCT检查

患者同时行宫颈HPV检测及LCT检查。患者于非月经期取样，取样前3 d禁性生活，无阴道用药，无盆浴，充分暴露宫颈，无菌棉球拭净阴道及宫颈口分泌物，取材采用JUNO一次性使用宫颈细胞采样刷(北京世纪众诺医疗器材有限公司)，将刷毛紧贴宫颈口，毛刷基底面沿宫颈外口顺指针旋转5圈，取出采样刷放入SafePath妇科细胞保存液(北京世纪众诺医疗器材有限公司)。推动取样刷杆的套装，使刷头落入保存液中，样本贴条形码。

HPV分型检测采用医用核酸分子快速杂交基因分型试剂盒(购自广东凯普生物科技股份有限公司)，包含15种高危HPV，即HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-5l、-52、-53、-56、-58、-59、-66和-68；6种低危型HPV DNA，即HPV-6、-11、-42、-43、-44、CP8304。HPV标本放入装有细胞保存液的样本管中，振荡器上振荡20 s，加入SafePath样本密度分离液，1 080 r/min，离心2 min 15 s，再吸取样本0.5 mL至离心管中，14 000 r/min离心1 min，弃上清，加入400 μL溶液Ⅰ，振荡，在沸水或者干浴锅上加热15 min。再加入400 μL溶液Ⅱ，盖上盖子，振荡数秒，使溶液Ⅱ充分混匀；室温下放置2 min，14 000 r/min离心5 min，去上清。14 000 r/min离心1 min，把剩余的残液吸干净，然后在室温下自然晾干3～5 min后，加入60 μL的溶液Ⅲ溶解DNA，在振荡器上振荡10 s左右。取上清液进行PCR反应。采用上海生工公司合成的HPV通用PCR引物MY(5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′，5′-GCMC AGGZGWCATAAYAATGG-3′，其中 R=A+G，W=A+T，Y=C+T，产物长度为452 bp)。PCR扩增体系为PCR混合液23.25 μL，DNA聚合酶0.75 μL，1 μL模板构成，通过博日PCR扩增仪进行。反向点杂交(HHM-2型医用核酸分子快速杂交仪)检测扩增产物与包被有型特异性探针膜杂交结果，采用碱性磷酸酶系统定性检测从而对21种HPV基因型进行分型检测。扩增时将反应管放入PCR扩增仪，按照凯普生物化学有限公司的人乳头状瘤病毒分型检测试剂盒(PCR+膜杂交法)说明书进行扩增。20℃、10 min；95℃、9 min；95 ℃、20 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，72℃、5 min，4℃ HOLD进行扩增，40个循环。杂交结果阳性判读为杂交条膜上的Biotin对照显色，同时HPV杂交点也显色。检测结果阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点。如果有一个或一个以上HPV分型点为阳性表示该类型HPV检测阳性。结果可为单一或混合HPV感染。

LCT采样同上，离心弃上清液后常温下用PsP50518制片染色一体机(TRiPath公司，美国)制片。细胞学检查结果由两位病理医师按照伯塞斯达系统(the Bethesda system，TBS)分级标准(2014版)分为：未见上皮内病变或恶性病变(negativefor intraepithelial lesion or malignancy，NILM)36 442例(96.66%，36 442/37 700)、非典型鳞状细胞，意义不明确(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)714例(1.89%，714/37 700)、低级别鳞状上皮内病变(low-gradesquamousintraepitheliallesion，LSIL)147例(0.39%，147/37 700)、非典型鳞状细胞，不排除高级别鳞状上皮内病变(atypical squamous cells cannot exclude HSIL，ASC-H)151例(0.40%，151/37 700)、高级别鳞状上皮内病变(high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)201例(0.53%，201/37 700)和鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)45例(0.12%，45/37 700)。

1.3 组织病理学检查

共3 924位患者进行了子宫颈活检，病理诊断按照妇科肿瘤病理诊断标准进行分类，由2位妇科肿瘤专业的病理医师进行阅片。其中诊断为慢性炎症者1 882例、宫颈LSIL者1 326例、宫颈HSIL者510例、SCC者203例、阴道鳞癌1例、鳞癌合并腺癌2例。以病理活检结果作为诊断金标准，其中阴道鳞癌1例及鳞癌合并腺癌2例不纳入本次统计，本文只统计发生在宫颈部位的单一的鳞状细胞病变。

1.4 统计学处理

使用SPSS 19.0软件建立数据库，计数资料率的比较采用频数分布进行统计，构成比和率的比较采用卡方检验，以α=0.05为检验水准。风险评估采用卡方检验2×2列表。

2 结果

2.1 HPV-52感染亚型频数分布及宫颈细胞学ASCUS及以上患者中常见型别

在37 700位患者中HPV-52的感染率为3.55%(1 338/37 700)，其中HPV-52单一感染率为65.92%(882/1 338)，HPV-52多重(指两种及以上HPV亚型)感染率为34.08%(456/1 338)。HPV-52多重感染456例中包含两重感染313例，三重及以上感染143例，两重感染中排在前3位的亚型依次是HPV-58/52(12.46%，39/313)、HPV-53/52(11.18%，35/313)和 HPV-16/52(11.18%，35/313)，见图1和图2。HPV-52多重感染者LCT筛查出ASC-US及以上病变患者中，最多见HPV-16/52型，宫颈细胞学HSIL患者中最多见HPV-16/52型。

图1 HPV-52两重感染频数分布

图2 HPV-52两重感染细胞学筛查异常分布

2.2 宫颈组织活检中HPV-52感染特点及风险

宫颈组织活检结果发现：与HPV-52单一感染比较，HPV-52/16多重感染患HSIL或者SCC风险增加(P＜0.01，OR=8.27)，并且增加从HSIL发展为SCC的风险(P=0.01，OR=12.65)，而包含HPV-52但不包含HPV-16的多重感染与HPV-52单一感染比较，患HSIL/SCC风险(P=0.51)和从HSIL发展为SCC的风险(P=0.41)均未明显增加。与包含HPV-52但不包含HPV-16多重感染比较，HPV-52/16多重感染患HSIL/SCC的风险(P＜0.01，OR=3.36)和从HSIL发展到SCC的风险(P=0.03，OR=1.29)均显著增加。与HPV-52单一感染比较，HPV-16单一感染患HSIL/SCC的风险(P＜0.01，OR=6.93)和从HSIL发展到SCC的风险(P＜0.01，OR=41.86)均显著增加，见表1及表2。

表1 HPV-52多重感染发生HSIL/SCC风险分析

3 讨论

HPV是球形DNA病毒，具有嗜上皮性，基因型众多，其中40种可以感染女性生殖道，并且存在地域性及种族差异。中国整体人群感染前5位的亚型分别为16、52、58、53和18[6-7]。HPV-52、-58、-16是韩国和我国华南地区宫颈上皮内病变最常见的感染亚型[8-9]。汕头市与厦门、漳州同属于东南沿海，地理位置邻近，具有相同的感染亚型HPV-58、-16、-18[10-11]。同时汕头又具有本市人群中特有的最常见感染亚型HPV-52。本研究发现HPV-52多重感染常见的亚型分别是HPV-58/52(12.46%，39/313)、HPV-53/52(11.18%，35/313)、HPV-16/52(11.18%，35/313)。从细胞学筛查结果中发现，含有HPV-52的多重感染中，细胞学异常患者，尤其是HSIL患者中最多见的是HPV-16/52感染。宫颈活检结果进一步证实，只要含有HPV-16亚型的感染，无论是与HPV-16单一感染还是包含HPV-52的多重感染，与HPV-52单一感染比较，均增加患HSIL或者SCC风险(P均＜0.01)，并且增加HSIL癌变风险(P均＜0.01)。Bruni等[12]Meta分析显示 HPV-16、HPV-18是全世界最常见的HPV致癌亚型。本研究结果与上述研究结果一致，本地区HPV感染致癌亚型主要是HPV-16。HPV-52单一感染活检结果为慢性炎症或者低度鳞状上皮内病变者248例，诊断为高度鳞状上皮内病变者43例，只有1例诊断为鳞状细胞癌。HPV-52多重感染不含HPV-16的患者活检中为慢性炎症或者鳞状上皮内低度病变者135例，诊断为鳞状上皮内高度病变者29例，无宫颈鳞状细胞癌患者。本研究结果表明无论HPV-52的单一感染与合并不包含HPV-16的多重感染比较主要发生慢性炎症或者LSIL、HSIL病变，并且不增加患HSIL或者SCC风险，也不增加癌变风险。So等[13]的研究结果中也证实HPV-52引起宫颈上皮内瘤变(CINII及CINI)。

总之，本研究发现HPV-52是汕头市HPV感染最常见亚型，该亚型主要引起宫颈LSIL或者HSIL病变，当HPV-52合并HPV-16感染时癌变风险增加，应重视HPV-52合并HPV-16患者的癌变风险防控。