己二酸二(2-乙基己基)酯灌胃染毒对大鼠的一般生殖毒性研究

石 莹，王 超，王 翀，顾 雯，张宏伟，段 链*

(中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100021)

己二酸二(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)adipate，DEHA]是一种己二酸酯类的增塑剂，具有一定的光、热稳定性和耐水性，为聚氯乙烯的一种优良耐寒增塑剂，常用于耐寒农用薄膜、电缆包覆层、人造革、户外用水管和冷冻食品的包装薄膜。DEHA与聚烯烃类塑料分子之间由氢键或范德华力连接，随时间的推移以及受温度的影响可从塑料中迁移出来，从而对外界环境造成污染[1-2]。单晓梅等[3]于2011—2012年对巢湖西半湖水以及合肥市两个水厂的水源水和出厂水进行增塑剂的调查和评估，发现巢湖水中DEHA的总体污染浓度较高，合肥市水源和出厂水中均检出DEHA，污染程度与水源周边工业废水和生活污水排放污染状况相符。陈丽等[4]于2008年对上海市以黄浦江为水源的管网水中微量有机物的污染状况进行调查也检出了含量较高的DEHA。除水体环境外，DEHA也广泛存在于大气、土壤和食品中，由于DEHA用于聚氯乙烯薄膜，因此食品也是人体暴露DEHA的主要来源。因其具有亲脂性、难以降解等特点，并且可以通过食物链逐渐传递并富集，最后以较高的浓度进入人体或其他动物体内。

我国已将DEHA列入优先控制污染物名单，其对环境和健康的影响不容忽视。本研究以DEHA为研究目标，参阅国内外权威机构关于DEHA的健康效应资料，结合美国环境保护署关于DEHA的健康参考值指定方法和经合组织化学品测试准则415“一代生殖毒性实验”，研究DEHA对亲代大鼠的一般毒性作用、交配行为和对胎仔生长发育的影响，为确定DEHA短期暴露健康敏感效应指标和建立短期暴露健康参考值积累动物实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择成年无生育史SD大鼠，清洁级，雄性动物为6～9周龄，雌性动物为9周龄，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，动物许可证号SCXK(京)2015-0005。

1.2 仪器与试剂

DEHA购于国药集团化学试剂北京有限公司，分析纯。以玉米油为溶剂。采用日立7180型生化分析仪检测总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、 球 蛋 白 (globulin， GLO)、 总 胆 固 醇 (total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、碱性磷酸 酶 (alkaline phosphatase， ALP)、 肌 酐 (creatinine，CREA)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血尿素(UREA)。大鼠血清生化检测试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 方法[5-7]

1.3.1 实验动物分组和染毒方法120只SD大鼠饲养于中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所SPF级动物实验室，室温22～24℃，12 h/12 h明暗交替，适应性饲养1周后随机分为低、中、高3个剂量[分别为28、170、1 080 mg/(kg·d)]DEHA染毒组和对照组，每组30只动物，雌雄比例为2∶1。染毒组大鼠采用灌胃方式给予受试物，每天灌胃1次，持续灌胃整个实验周期，各组雄鼠结束染毒后，雌鼠在交配期、妊娠期持续染毒至实验结束，每周测量1次体质量调整灌胃量；对照组大鼠自由摄食饮水。

雄鼠染毒10周、雌鼠染毒2周后同组动物合笼，合笼雌雄比例为2∶1，合笼期间每天早晨检查阴栓，见阴栓日规定为受孕第0天，合笼时间最长为21 d。合笼结束处死雄鼠和未交配成功雌鼠，交配成功雌鼠受孕第19天时处死。

1.3.2 检测指标及方法实验期间，每天观察并记录大鼠的一般状况及摄食、饮水和死亡情况。定期测量动物体质量，记录交配成功的动物数、交配成功天数、怀孕动物数、每窝胎仔数和胎仔体质量。

采用腹主动脉采血分离血清，检测血清中TP、ALB、 GLO、 TC、 TG、 ALP、 CREA、 ALT、 AST、UREA。采血后解剖取肝、肾、卵巢、睾丸、附睾分别称取质量，计算脏器系数(脏器质量/体质量×100%)并固定于中性甲醛溶液中，进行组织病理学检查。

1.4 统计分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐性时用SNK方法分析，方差不齐时用Dunnett方法分析。

2 结果

2.1 DEHA染毒对亲代大鼠体质量、脏器质量及脏器系数的影响

DEHA染毒对亲代大鼠体质量、脏器质量及脏器系数的影响见表1和表2。由表1可见，与对照组比较，高剂量组亲代雄性大鼠终体质量降低(P＜0.01)、睾丸脏器系数升高(P＜0.05)。表2显示，与对照组比较，高剂量组亲代雌性大鼠肝、肾质量及肝、肾脏器系数均升高(P＜0.01或P＜0.05)，其余指标未出现明显变化。

表1 DEHA染毒对亲代雄性大鼠体质量、脏器质量及脏器系数的影响（n=10）

表2 DEHA染毒亲代雌性大鼠体质量、脏器质量及脏器系数的影响（n=20）

2.2 DEHA染毒对亲代大鼠血清中肝、肾和代谢相关生化指标的影响

DEHA染毒对亲代大鼠血清中肝、肾和代谢相关生化指标的影响见表3和表4。表3显示，高剂量组亲代雄性大鼠AST水平、CREA水平与对照组比较均升高(P＜0.05)；低、中剂量组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。表4显示，低剂量组亲代雌性大鼠AST水平与对照组比较降低(P＜0.05)；高、中剂量组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。高剂量组亲代雌性大鼠GLO、TC水平与对照组比较均升高(P＜0.05)；低、中剂量组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。其余指标未出现明显变化。

表3 DEHA染毒对亲代雄性大鼠血清中肝、肾和代谢相关生化指标的影响（n=10）

表4 DEHA染毒对亲代雌性大鼠血清中肝、肾和代谢相关生化指标的影响（n=20）

2.3 DEHA染毒对亲代大鼠交配行为及胎仔体质量的影响

见表5。与对照组相比较，高剂量组的胎仔体质量降低(P＜0.01)；低、中剂量组与对照组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。DEHA染毒对亲代大鼠交配行为无明显影响。

2.4 大鼠肝、肾、睾丸和卵巢组织病理学检查结果

各DEHA染毒组动物肝脏组织结构及肝细胞分化未见异常，汇管区未见小胆管及结缔组织增生。各DEHA染毒组中动物的肝脏中出现极少量的小空泡，见图1A，以及肝脏小叶或者肝脏静脉周围有极少量的灶性坏死炎性细胞浸润，见图1B。

各DEHA染毒组动物肾脏被膜完整，皮、髓质边界清楚，肾小球均匀分布于皮质区，结构正常；各DEHA染毒组均观察到肾脏肾小管或集合管间隙出现极少量的炎性细胞浸润，见图1C。

各DEHA染毒组雄性动物睾丸生精上皮发育良好，并有成熟精子形成，支持细胞、间质细胞未见增生，见图1D。附睾管、输出小管结构未见异常，管腔内均可见大量成熟精子，见图1E。

各DEHA染毒组雌性动物卵巢内可见各发育阶段卵泡及黄体，无出血、囊肿、纤维化病变。均观察到黄体增大(1级)，见图1F。

表5 DEHA染毒对亲代大鼠交配行为及胎仔体质量的影响

图1 DEHA染毒大鼠组织病理切片典型示例图(HE染色，×10)

3 讨论

DEHA作为聚氯乙烯的一种优良耐寒增塑剂，广泛应用于建筑材料、食品包装袋、儿童玩具、医疗器械，随着降解、迁移已经成为我国水环境中广泛存在的有机污染物。饮用水污染和食品污染成为DEHA进入人体的主要途径，所引起的健康风险越来越受到关注。本试验参考OECD 415一代生殖毒性研究的方法选用SPF级SD大鼠，从亲代大鼠的一般症状、血清学指标和脏器病理检查以及胎仔的数量和体质量等方面对DEHA灌胃染毒引起的大鼠一般生殖毒性效应进行评估。

Arrington等[8]发现给大鼠饲喂含有DEHA的食物一个月，在2.5 g/kg剂量水平上会阻碍其生长；Smyth等[9]研究表明，给Sherman大鼠饲喂含DEHA的食物90 d，在2.92 g/kg剂量水平发现大鼠出现生长受限，显微镜下发现肝、肾中出现损伤。本研究发现，高剂量组[1 080 mg/(kg·d)]经口灌胃给予DEHA，大鼠终体质量与对照组比较降低，差异有统计学意义。终体质量降低能从一定程度上反映DEHA灌胃染毒引起大鼠生长受限，可能是因为DEHA染毒引起大鼠食欲不振。与以往文献报道相比，引起体质量增长受限的剂量水平低，可能是因为本实验采用灌胃染毒可以准确控制药量，减少饲喂染毒造成受试物损失。高剂量组[1 080 mg/(kg·d)]经口摄入DEHA，雌性大鼠肝、肾脏器系数和雄性大鼠睾丸脏器系数升高，可能是因为DEHA引起过氧化物酶体增殖导致肝、肾组织增生质量增加[10]。AST、TC、GLO和CREA血生化指标水平异常也从另一个角度证明经口摄入DEHA对大鼠肝肾有影响。病理镜检各实验组均发现肝脏中出现极少量的小空泡以及肝脏小叶或者肝脏静脉周围有极少量的灶性坏死炎性细胞浸润、肾小管或集合管间隙出现极少量的炎性细胞浸润和黄体增大(1级)，但是各剂量组与对照组并无明显区别。

Dalgaard等[11]发现DEHA可造成出生Wistar仔鼠体质量明显下降，本研究发现高剂量组[1 080 mg/(kg·d)]胎仔体质量降低，与对照组比较差异有统计学意义，可能是因为DEHA对母体有轻度影响从而造成对胎仔也有轻微影响。除此之外并未发现DEHA对大鼠的生殖能力造成影响，与以往文献报道结果一致。

综上所述，高剂量组DEHA灌胃染毒会引起大鼠生长受限，肝、肾和睾丸增生，AST、TC、GLO和CREA血生化指标水平异常，胎仔体质量降低。表明灌胃染毒DEHA对大鼠有轻微的毒性，主要作用于肝、肾等组织，同时因为对母体的影响造成对胎体发育有一定影响。本研究针对DEHA暴露对亲代大鼠的一般毒性、交配行为和对胎仔生长发育的影响进行了初步研究，为DEHA健康风险评估提供实验室依据。