猪Delta冠状病毒及其检测技术研究进展

高光健 福建省光泽县动物疫病预防控制中心 福建光泽 354100

猪 Delta冠状病毒 （Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）能引起猪Delta冠状病毒病（Porcine Deltacoronavirus Disease，PDCoVD），该病能导致猪腹泻等肠道症状，且具有传染性，在猪的各发育阶段均能被感染并引起发病。在各发育阶段中，处于哺乳期的仔猪最容易受到该病毒的危害，能继发感染多种疾病，也易与其他猪病形成混合感染，从而使猪死亡率升高，给猪养殖业带来一定的经济损失。本文对PDCoV病原学、流行病学特征以及该病毒检测技术研究现状进行概述，旨在为未来PDCoV感染的流行病学调查和疫情防控提供参考。

1 病原学特征

PDCoV是一种单股正链RNA病毒，病毒粒子的形态具有多型性，且外膜上有若干棒状突起结构，直径为 60～18 nm，呈典型的“皇冠”状[1-2]。

目前PDCoV是已知基因组最小的一类冠状病毒，全长25 400 nt，且PDCoV具有与其他冠状病毒类似的基因组成和排列[3-5]，由5'UTR、复制相关基因（1a，1b）、S 基因、E 基因、M 基因、NS6、N 基因、NS7及3'UTR组成，其中包括4个非结构基因和4个结构基因[6]；基因排列为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-EM-NS6-N-NS7-3'UTR，依次编码对应的功能蛋白，见图1。

5'UTR全长511～540 nt，能调控病毒的转录。多聚酶蛋白基因全长为19 000 nt，由两个OFR（开放阅读框）：ORF1a（编码多聚蛋白 pp1a）、ORF1b（编码多聚蛋白pp1ab）构成，且pp1a与pp1ab都能进行水解，水解产物为15个NSP（非结构蛋白），NSP能参与病毒转录和复制。S基因的全长为3 480 nt，编码PDCoV的纤突蛋白（S），属于I类糖蛋白，当病毒入侵机体细胞时S蛋白前体发生水解，经加工后形成具有受体结合功能的S1蛋白和具有跨膜融合功能的S2蛋白，能在病毒结合宿主细胞特异性受体中发挥重要作用[7]。E基因是PDCoV最小的结构基因，编码PDCoV分子量最小的结构蛋白-小膜蛋白（E）。该蛋白主要位于高尔基体和内质网高尔基体中间室，对病毒的产生与形成有重要作用[8]。M基因全长654 nt，编码PDCoV病毒粒子的膜蛋白（M）。M蛋白为跨膜蛋白，外域小，内域羧基端大，构成了病毒包膜中与其他结构蛋白相互联系的桥梁[9]。N基因全长1 029 nt，编码PDCoV的核衣壳蛋白（N），N蛋白在病毒感染细胞的过程中产生得最早和最多，且能够与病毒基因组结合形成螺旋状的核糖核蛋白复合物从而保护病毒基因组不受病毒外因子的侵袭[10]。

2 流行病学特征

感染PDCoV的母猪、仔猪会出现食欲不振、腹泻、呕吐及脱水等症状，且各阶段猪群均易感PDCoV，感染后仔猪的死亡率为30%～40%[1]。PDCoV不仅能单独感染猪群使其患病，还可与其他致病病毒混合感染，例如与库布病毒（PKoV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）混合感染后，混合感染率为44.4%[11]。Woo等[12]首次对香港的169份猪腹泻粪便进行PDCoV检测，结果显示PDCoV的阳性检出率为10.1%（17/169）。随后，该病于2014年2月在美国俄亥俄州暴发，对美国以及加拿大部分地区的293份猪腹泻粪便进行PDCoV检测，PDCoV的阳性检出率为30%（89/293）[13]。 泰国和韩国均检测到 PDCoV，泰国样本阳性率为87%[14-15]。国内研究人员也广泛调查了PDCoV在我国的发病情况。张帆帆等[16]对江西省的249份猪腹泻样品进行了检测，结果共检出78份PDCoV 阳性（31.33%）。 Zhai等[17]对海南、广东地区猪场的390份粪便样品进行PDCoV检测，结果阳性样品检出率为1.28%（5/390）。宋亚兵等[18]在对2012-2016年间采集的420份猪腹泻粪便进行PDCoV病原检测后发现，样品阳性检出率为13.33%（56/420），且PDCoV能与PEDV混合感染，感染率5.95%。上述研究结果说明，PDCoV除能单独感染外，还能与PEDV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）混合感染猪只，研究还表明PDCoV与PEDV的混合感染率更高[19]。此外，PDCoV与其他细菌或病毒混合感染猪只时，其症状比单个病毒感染严重得多，这给养殖户带来巨大的经济损失[20]。

有关研究指出，夏季PDCoV阳性检出率较低，而在冬季较高，这表明PDCoV呈季节性流行[21-22]。宋亚兵等[18]对420份腹泻猪的临床样品检测中发现，春、夏、秋、冬4个季节的PDCoV阳性样品检出率分别为 35.7%、10.7%、12.5%、41.1%，表明春冬季是PDCoVD的高发季节，PDCoV的发生呈现明显的季节性。这是由于冬春季节气温变化幅度较大，初生仔猪抵抗力较弱，易产生应激，造成肠道功能紊乱以及病毒性腹泻发生。

3 检测技术

PDCoV与PEDV、TGEV等病毒感染的临床症状表现极为类似，且常有PEDV与PDCoV混合感染，临床上难以确诊。目前，实验室检测是诊断PDCoV感染的主要手段，检测方法可分为抗原检测和抗体检测，抗原检测包括常规RT-PCR、巢式RTPCR、荧光定量RT-PCR、免疫细胞化学分析、高通量测序等；抗体检测技术主要是间接ELISA法。

3.1 常规RT-PCR法 目前检测PDCoV最常用的检测方法是常规RT-PCR，该检测方法具有操作简捷、方便、稳定性、灵敏度高等优势。逢凤娇等[23]以PDCoV的M基因为目的片段建立了一种常规RTPCR检测法，仅对PDCoV的核酸扩增结果呈阳性，且具有较高的检测敏感度，最低检出量为6.33×104copies/μL。张帆帆等[16]则以PDCoV的N基因为目的片段，建立了一种特异性检测PDCoV的常规RT-PCR 法，其最低检测限为 1.0×103copies/μL。

由于PDCoV、PEDV、TGEV等能引起仔猪腹泻，仅仅通过临床症状和剖检很难鉴别诊断，建立同时检测且能够鉴别诊断这些疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义，可为临床上疫病快速检测和流行病学调查奠定良好的基础。韦学雷等[24]用三重RT-PCR法对PDCoV、TGEV和PEDV进行特异性扩增检测，结果表明PDCoV的最低检测限为3.14×103copies/μL，TGEV 的最低检测限为 3.68×104copies/μL， PEDV 的最低检测限为 3.88×104copies/μL。王睿敏等[25]研究表明，用多重RTPCR 法检测 PDCoV、PEDV、PKoV、TGEV 特异性较好，除以上四种病毒外，对其他病毒核酸均无扩增现象，对以上四种病毒的重组质粒标准品的最低检测限分别为 1.57×102copies/L、1.57×102copies/L、1.57×102copies/L、1.57×103copies/L。 利用多重 RT-PCR法对广西地区270份猪腹泻粪便进行检测，结果表明PDCoV检出率为10.74%，PEDV检出率为15.56%，PKoV检出率为 1.85%，TGEV检出率为11.48%，且存在混合感染的现象。

3.2 巢式RT-PCR法 巢式RT-PCR法可有效防止试验过程中出现假阳性的现象，以提高检测的特异性、灵敏性、准确性。陈小芬[26]对PEDV进行巢式RT-PCR检测后发现，该方法具有很好的特异性，仅对PEDV的扩增为阳性；且该方法具有较高的反应敏感性，巢式 RT-PCR检测限可达 2.84 pg/μL，而 常规 RT-PCR检测限 284 pg/μL，两者相差100倍。Song等[27]根据PDCoV的N基因片段建立了巢式RT-PCR方法，扩增的两个片段大小分别是238 bp和614 bp，并对356份采集自江西省的猪腹泻病料样品进行了巢式RT-PCR检测，结果表明PDCoV的阳性检出率为33.71%（120/356）。

3.3 荧光定量RT-PCR法 荧光定量RT-PCR法又称qRT-PCR，不仅具有精确度高、特异性好、敏感度高、检测速度快等优势，而且扩增结果无需电泳检测，直接观察即可，因此，防止了环境气溶胶污染而造成假阳性结果。秦毅斌等[28]通过构建PDCoV的N基因保守区TaqMan探针和特异性引物，建立了一种TaqMan实时荧光定量RT-PCR法，可特异性扩增PDCoV，最低检测限为2.2 copies/L。罗尚星等[29]为了快速准确检测PDCoV和PEDV，依据PDCoV的N基因和PEDV的M基因保守序列，分别构建了PDCoV、PEDV的特异性引物，建立了双重SYBR Green I荧光定量RT-PCR法，该方法特异性较好，且检测下限分别为51 copies/μL、32 copies/μL。 Masuda 等[30]分别构建了 PDCoV、PEDV、TGEV和PKoV四种病毒特异性的引物，建立了一种qRTPCR检测方法，可在75 min内诊断并区分这四种猪腹泻病毒，其敏感性是常规PCR检测方法的1～1 000倍，为PDCoV感染的临床诊断提供了一种耗时短、强特异性、高灵敏度的检测方法。

3.4 高通量测序技术 高通量测序技术 （Highthroughput sequencing，HTS）能一次性测定若干DNA分子核苷酸序列，且具有高灵敏度、高通量和低成本等优势，在临床诊断应用和基因组学研究领域具有广阔的应用前景。Dong等[31]利用HTS技术从野生亚洲豹猫和中国白鼬中发现了Delta冠状病毒；Ajayi等[32]通过HTS技术检测了加拿大安大略省2014-2016年间的猪腹泻病料，并分析PDCoV和PEDV的发病率和流行规律。

3.5 间接ELISA法 PDCoV的S1蛋白区域决定着病毒的致病性和宿主范围，是S蛋白诱导机体产生中和抗体的主要位点和主要的抗原受体结合区域。Thachil等[33]将PDCoV的S1基因与真核表达载体连接，转染HEK-293T细胞表达PDCoV S1蛋白，再利用纯化的S1蛋白建立了一套间接ELISA检测法，ELISA检测具有较好的特异性及灵敏度，且不与PEDV、TGEV等其它冠状病毒发生交叉反应。闫瑞杰等[34]研究表明，通过间接ELISA法可特异性检测PDCoV，依据PDCoV的N基因，制备的N蛋白和多克隆抗体仅与PDCoV的阳性血清发生交叉反应。对河南165份猪血清样品进行间接ELISA检测，PDCoV阳性检出率为53.94%。

4 结 语

PDCoV是近年来新发现的导致仔猪腹泻、呕吐和脱水的肠道致病性冠状病毒，且目前尚无预防疫苗和特效治疗药物。预防PDCoV最好的方法是加强猪场养殖管理，如采用全进全出、自繁自养的养殖制度；提高猪只免疫力，完善猪场免疫程序，进行严格引种检疫，平时进行严格的病毒抗原、抗体检测。若检测到PDCoV，应马上对猪群进行隔离、消毒，主要遵循消炎抗菌、对因治疗、维持体内电解质平衡及补充能量等治疗原则，这样可有效避免患猪的继发感染和脱水死亡。因此，急需建立特异性的检测方法，用来准确、快速地诊断PDCoV感染情况，通过综合评估猪群中的PDCoV感染水平，建立健全完善的PDCoV监测体系，对PDCoV感染的流行病学调查和疫情防控具有重要意义，为养猪业的健康发展提供重要参考。