基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测方法

马 来，童桂香，韦信贤，曾德乾，熊建华，王 瑞，黄光华，江林源

(1.北海南方海洋生态养殖有限公司，广西 北海 536000；2.广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西 南宁 530021；3.南宁市武鸣区陆斡镇水产畜牧兽医站，广西 南宁 530111；4.广西柳州种畜场，广西 柳州 545003)

【研究意义】虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)隶属于肠胞虫科(Enterocytozoonidae)肠胞虫属(Enterocytozoon)，是一种专性细胞内寄生的微孢子虫，在2004年最早发现于泰国养殖的斑节对虾，于2009年首次被分离和正式命名报道，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等重要养殖虾类，是近年来危害养殖对虾的主要病原之一[1-3]。EHP可通过水平和垂直传播，但主要经口摄食寄生有EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或水体中的孢子体而感染[4-5]。EHP感染主要导致养殖对虾生长缓慢甚至停滞，表现为对虾消瘦、大小不均、重量离散[6]，且患病对虾肝胰腺遭到破坏，免疫力降低，极易被其他病原侵染而死亡，给对虾养殖业带来严重经济损失[7]。目前，EHP已对全球对虾产业构成严重威胁，在印度、委内瑞拉、中国、泰国、越南、马来西亚及文莱等国家均有报道[8-12]。EHP的危害与其感染数量密切相关，轻度感染基本上不影响对虾的生长发育，中度感染影响对虾的营养吸收，严重感染损坏对虾免疫系统[13]。因此，建立一种快速且准确的EHP定量检测方法，在虾苗检疫、亲虾筛选及成虾养殖疫情监测过程中根据其定量数据及对虾养殖模式制定相应措施，对有效防控由EHP引起的虾病害具有重要意义。【前人研究进展】EHP感染前期无明显病症，需采用组织学方法或分子生物学方法等实验室手段检测才能确诊。鉴于此，EHP检测方法得到快速发展，现已研发出多种快速检测方法应用于实际检测，包括原位杂交、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增(LAMP)等[14-17]。这些检测方法在灵敏度和便捷程度上各有优缺点，因此如何更快速、高效、准确地检测EHP仍有待进一步研究和探索。相对于普通PCR，荧光定量PCR的检测和分析过程均在密闭的单管里由机器自动完成，具有自动化程度高、有效解决PCR产物污染问题及能定量检测病原体感染等优点[18-19]，被认为是实验室检测病原的最理想方法；TaqMan-MGB探针是荧光定量PCR使用的一种荧光探针，其3′端淬灭基团为不发光的MGB结合物，可实现高Tm值的探针长度缩短而有利于提高方法的灵敏度，且探针3′端不发光的淬灭基团与5′端报告基团在空间的位置更接近，使荧光本底降低、检测结果分辨率更高[20-21]，因此TaqMan-MGB探针在人类及动植物各种病原体的定量检测中得到广泛应用[22-26]。【本研究切入点】至今，国内尚未发布EHP检测的相关标准，农业农村部在虾肝肠胞虫病(EHPD)监测计划中仍推荐采用套式PCR，但在实际检测工作中，套式PCR存在操作繁琐、检测时间长和不能定量等缺点，无法满足对EHP进行快速定量检测的需求。鉴于TaqMan-MGB探针应用于荧光定量PCR的优势，将其应用于EHP定量检测必将有助于实现EHPD的快速诊断及有效防控。【拟解决的关键问题】建立一种基于TaqMan-MGB探针的EHP荧光定量PCR检测方法，以提高检测灵敏度及其效率，为EHP快速定量检测及实时监测提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

EHP、虾虹彩病毒(SIV)、白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、哈维弧菌(Vibrioharveyi)和创伤弧菌(V.vnlnificus)的阳性材料均由广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室保存提供；健康无EHP感染凡纳滨对虾采自广西水产科学研究院SPF凡纳滨对虾良种场；276份虾样品采自广西北海、钦州、防城港等地养殖场，其中2018和2019年分别收集142和134份。动物组织基因组DNA快速提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker和氨苄青霉素购自北京艾德莱生物技术有限公司；pMD18-T载体克隆试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Premix ExTaqTM(Probe qPCR)购自宝生物工程(大连)有限公司；琼脂糖购自广州英韦创津生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。荧光定量PCR仪(Mx3005P)为安捷伦公司产品。

1.2 引物及TaqMan-MGB探针设计与合成

编码核糖体小亚基的基因序列区(SSU rDNA)包含保守区和高变区，其中保守区序列进化缓慢且相对保守，常被用作寄生虫检测的靶基因[27]；叶键等[28]研究表明，SSU rDNA基因较孢子壁蛋白基因(SWP)更适合作为检测EHP的靶基因。因此，按荧光定量PCR扩增引物和TaqMan-MGB探针的设计原则，采用Primer Express 3.0在SSU rDNA基因(KF362129)保守区域设计多组特异性扩增引物和TaqMan-MGB探针，其中探针5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团，并通过NCBI数据库进行BLAST同源性比对，验证其特异性后委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。经试验初筛，选择一套效果较好的扩增引物及TaqMan-MGB探针(表1)用于EHP荧光定量PCR检测方法的建立。

表1 荧光定量PCR扩增引物及TaqMan-MGB探针信息

1.3 病原DNA提取

取30 mg阳性病料组织，按照动物组织基因组DNA快速提取试剂盒说明书提取虾常见病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈维弧菌和创伤弧菌的DNA，最后加60.0 μl洗脱缓冲液溶解DNA，-20 ℃保存备用。

1.4 重组质粒标准品制备

以EHP的DNA为模板，灭菌水为空白对照，进行荧光定量PCR检测。在20.0 μl反应体系中加入2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各0.4 μl，EHP-qP66(10 μmol/L)0.4 μl，DNA模板2.0 μl，灭菌水补足至20.0 μl。扩增程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，进行40个循环；在60 ℃结束时收集荧光信号。荧光定量PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，制备重组质粒pMD18-T-SSUEHP，并进行PCR及测序鉴定。提取重组质粒pMD18-T-SSUEHP，用核酸蛋白分析仪测定其浓度并转换为拷贝数，以10倍梯度稀释至1.0×109～1.0×100拷贝/μl作为标准品，-20 ℃保存备用。

1.5 荧光定量PCR反应体系优化

以3个梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷贝/μl)的标准品DNA为模板，反应体系中其他成分浓度不变，将上、下游引物浓度以0.1 μmol/L递增设为0.1～0.8 μmol/L，根据扩增反应的循环阈值(Ct)和扩增曲线的荧光信号强度(ΔRn)选择最佳引物浓度。同时，以3个梯度(1.0×109、1.0×106和1.0×103拷贝/μl)的标准品DNA为模板，反应体系中其他成分浓度不变，将TaqMan-MGB探针浓度以0.1 μmol/L递增设为0.1～0.8 μmol/L，根据扩增反应的Ct值和ΔRn选择最佳探针浓度。

1.6 标准曲线建立及敏感性试验

以10个梯度(1.0×109～1.0×100拷贝/μl)的标准品DNA为模板，采用优化后荧光定量PCR进行检测；利用数据分析软件进行分析，建立起始模板拷贝数(x)对数与Ct值(y)间的标准曲线和线性回归方程，并根据各标准品DNA的扩增结果判断该方法的定量范围和敏感性。

1.7 特异性试验

分别以EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈维弧菌和创伤弧菌的DNA为模板，采用优化后的荧光定量PCR进行检测，评价其特异性。

1.8 重复性试验

选取3个梯度(1.0×107、1.0×105和1.0×103拷贝/μl)的标准品DNA为模板，在间隔第7和14天分别进行重复试验，每个梯度设3个平行，记录各次试验的Ct值，分析组内及组间的Ct值变异系数，检测标准品的稳定性及该方法的重复性。

1.9 荧光定量PCR与套式PCR的敏感性比较

按1.3的方法提取EHP阳性病料组织DNA，以10倍梯度稀释(100～10-5)，取2.0 μl各梯度DNA为模板分别采用优化后的荧光定量PCR和农业农村部EHP监测计划推荐的套式PCR进行检测，比较其敏感性。

1.10 荧光定量PCR和套式PCR检测临床样品的比较

按1.3的方法提取临床样品DNA，分别用荧光定量PCR和套式PCR对276份临床虾样品(凡纳滨对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和红螯螯虾)进行检测，比较检测结果以检验荧光定量PCR的临床实用性。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品制备情况

以EHP的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，可获得与预期目的片段大小一致的特异性条带(图1)；重组质粒pMD18-T-SSUEHP经PCR鉴定及测序分析，所得的目的片段序列与GenBank已公布EHP-SSU rDNA基因对应部分序列的同源性为100 %，说明目的基因片段正确插入pMD18-T载体，即重组质粒pMD18-T-SSUEHP构建成功。取阳性克隆菌液提取质粒，测定浓度并转换为拷贝数，重组质粒pMD18-T-SSUEHP浓度为6.83×109拷贝/μl，OD260/OD280为1.96，满足标准品的要求。

M：DL500 DNA Marker；1～3：EHP-SSU rDNA基因；4～5：重组质粒pMD18-T-SSUEHP；NC：阴性对照

2.2 荧光定量PCR反应体系优化结果

分别以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷贝/μl的标准品DNA为模板，上、下游引物浓度为0.1～0.8 μmol/L时的荧光定量PCR扩增结果显示，随着引物浓度的增大，ΔRn增大、Ct值减小，但引物终浓度在0.6～0.8 μmol/L时的扩增效果(Ct值和ΔRn)差异不明显。图2为以1.0×106拷贝/μl标准品DNA为模板的扩增结果。经3次重复试验，为保证引物的扩增效率且不浪费试验材料，确定0.6 μmol/L为最佳引物终浓度。

图2 荧光定量PCR的引物浓度优化结果

分别以1.0×109、1.0×106和1.0×103拷贝/μl的标准品DNA为模板，TaqMan-MGB探针浓度为0.1～0.8 μmol/L时的荧光定量PCR扩增结果显示，随着探针浓度的增大，ΔRn增大、Ct值减小，但探针终浓度在0.5～0.8 μmol/L时的扩增效果(Ct值和ΔRn)差异不明显。图3为以1.0×106拷贝/μl标准品DNA为模板的扩增结果。经3次重复试验，为保证TaqMan-MGB探针的效率且不浪费试验材料，确定0.6 μmol/L为最佳探针浓度。

图3 荧光定量PCR的TaqMan-MGB探针浓度优化结果

通过引物浓度和探针浓度优化后，确定基于TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR最佳反应体系：2×Probe qPCR Premix ExTaqTM10.0 μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μl，上、下游引物EHP-qF66/EHP-qR66(10 μmol/L)各1.2 μl，TaqMan-MGB探针EHP-qP66(10 μmol/L)1.2 μl，DNA模板2.0 μl，用灭菌水补足至20.0 μl。

2.3 荧光定量PCR扩增标准曲线及其敏感性

以10倍梯度稀释的标准品DNA(1.0×109～1.0×100拷贝/μl)为模板进行荧光定量PCR扩增，结果(图4)显示各梯度标准品的扩增曲线重复性好、荧光强度增量明显，高浓度标准品(1.0×109～1.0×103拷贝/μl)的扩增曲线呈典型的S形，低浓度标准品(1.0×102～1.0×100拷贝/μl)的扩增曲线因未达扩增平台期而呈半S形，阴性对照和空白对照均未出现任何扩增曲线。经数据分析建立标准曲线，起始模板拷贝数为2.0×109～2.0×100拷贝/μl时，模板浓度对数与Ct值间呈良好的线性关系(图5)，对应的线性回归方程为y=-3.232×lg(x)+39.51，Eff.(扩增效率)和RSq(相关系数方值)分别为103.9 %和1.000。标准品DNA为20拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为34.81、34.88和34.91，仍有明显的扩增曲线，且重复性好；标准品DNA为2拷贝/反应时，3个重复的Ct值分别为37.84、38.28和38.71，重复性差。因此，为保证检测结果的准确性，建议在实际检测工作中以Ct值35.00为临界值，若检测样品的Ct值小于或等于35.00，且有扩增曲线，判为EHP阳性；Ct值大于35.00，且有扩增曲线，则重复1次，如结果一致，判为EHP阳性；Ct值大于35.00，重复结果未出现扩增曲线，判为EHP阴性。综上所述，基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法对标准品具有很高的扩增效率，标准品起始模板为2.0×109～2.0×101拷贝/反应时，建立的标准曲线能准确反映目的产物的扩增情况，可用于EHP的定量分析，其灵敏度约20拷贝/反应。

图4 标准品DNA的荧光定量PCR扩增曲线(1.0×109～1.0×100拷贝/μl)

图5 荧光定量PCR检测EHP的标准曲线

2.4 荧光定量PCR的特异性

采用优化后的荧光定量PCR对虾常见病原EHP、SIV、WSSV、IHHNV、VpAHPND、哈维弧菌和创伤弧菌的DNA进行检测，结果显示只有EHP出现扩增曲线(图6)，Ct值分别为22.07、22.10和22.16，判为阳性；而其他病原及阴性对照、空白对照均未出现扩增曲线，判为阴性。说明基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR对EHP检测具有很强的特异性。

图6 荧光定量PCR特异性检测结果

2.5 荧光定量PCR的重复性

以1.0×107、1.0×105和1.0×103拷贝/μl的标准品DNA在间隔第7和14天分别进行重复试验，结果(表2)显示，其组内的试验变异系数(CV)为0.26 %～0.72 %，组间试验变异系数为0.56 %～0.92 %，表明基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR重复性好，检测结果稳定可靠；同时说明本研究制备的重组质粒DNA稳定性好，可作为标准品和阳性对照使用。

表2 荧光定量PCR的重复性试验结果

2.6 荧光定量PCR与套式PCR的敏感性比较

分别采用基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR和套式PCR对10倍梯度稀释的EHP阳性DNA (100～10-5)进行检测，结果显示，荧光定量PCR可检测到10-4稀释度的阳性DNA(图7)，而套式PCR可检测到10-3稀释度的阳性DNA(图8)，即荧光定量PCR的敏感度较套式PCR高一个数量级(10倍)。

图7 荧光定量PCR的敏感性检测结果

M：DL500 DNA Marker；1～6：套式PCR第一轮PCR产物；7～12：套式PCR第二轮PCR产物；NC：阴性对照

2.7 荧光定量PCR和套式PCR检测临床样品的结果比较

分别采用基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR和套式PCR对276份临床虾样品进行检测，结果(表3)显示，有46份虾样品用两种方法检测均为阳性，Ct值为15.73～32.91，根据标准曲线方程y=-3.232×lg(x)+ 39.51计算，其EHP拷贝数在1.10×102～2.28×107拷贝/反应，虾样品的EHP含量为1.10×102～2.28×107拷贝/mg；有8份虾样品经荧光定量PCR检测呈阳性而经套式PCR检测呈阴性，Ct值为33.16～36.49，其EHP拷贝数在9.2×101～8.6×100拷贝/反应，虾样品的EHP含量为9.2×101～8.6×100拷贝/mg；有221份虾样品用两种方法检测均为阴性，即两种方法的符合率为96.7 %。说明在实际检测工作中采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR进行40个循环的扩增反应，可提高EHP低拷贝数样品的检出率，其检测灵敏度约10拷贝/mg。2018和2019年广西虾样品的EHP阳性率分别为16.2 %(23/142)和30.6 %(41/134)，主要检出品种为凡纳滨对虾。

表3 采用荧光定量PCR和套式PCR检测临床样品EHP结果比较

3 讨 论

我国于2013年首次证实在养殖凡纳滨对虾中存在EHP感染，并于2017年将EHPD纳入国家水生动物疫病监测计划。近年来的监测结果显示，EHP阳性率一直占据对虾疫病之首，EHP感染已蔓延至我国所有对虾养殖地区，包括广东、广西、海南、福建、山东、江苏、浙江、天津等沿海地区及新疆等内陆地区，感染品种包括凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、克氏原螯虾和青虾等我国主要养殖虾类品种，说明EHPD在我国的流行传播形势十分严峻，已成为制约我国当前虾类养殖业健康发展的重要疫病[29]。EHP感染的苗种和养殖对虾是EHPD传播的重要风险源。因此，为避免该病原的传播扩散和发生发展，亟需研发出一种方便快捷的检测方法。目前，世界动物卫生组织(OIE)和国内均未发布EHP检测的相关标准，农业农村部在EHPD监测计划中推荐采用套式PCR进行检测，但在实际检测工作中套式PCR需两轮PCR及电泳，操作繁琐、检测耗时长且不可定量；此外，EHP感染数量与其危害密切相关的特点需对EHP进行准确定量检测，才能根据EHP定量数据制定相应的预防或预后措施，套式PCR显然已无法满足对EHP进行快速定量检测的要求。基于TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR既能克服套式PCR的上述缺点，又能发挥荧光定量PCR的优势，尤其是TaqMan-MGB探针连接的MGB淬灭基团具有探针长度短、荧光本底小、稳定性好及分辨率高等特点，非常适用于病原体的定量检测[30]。

本研究鉴于EHP定量检测的需求及TaqMan-MGB探针应用于病原体检测的优势，在EHP的SSU rDNA基因保守序列设计特异性引物及TaqMan-MGB探针，制备重组质粒标准品pMD18-T-SSUEHP，并对反应体系进行优化以确定检测EHP的荧光定量PCR最佳条件，结果表明，重组质粒pMD18-T-SSUEHP的DNA稳定性好，其浓度和纯度均能满足作为标准品和阳性对照的要求；建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR对标准品的扩增效率高，起始模板范围在2×101～2×109拷贝/反应时，其扩增标准曲线的线性关系良好，能准确反映目的产物的扩增情况；灵敏度高，对标准品的检测灵敏度可达20拷贝/反应，对虾样品的EHP检测灵敏度约10拷贝/mg，较套式PCR约提高10倍；特异性强，对虾类其他常见病原均无扩增反应；重复性好，组内和组间变异系数均小于1.00 %；此外，扩增和产物分析同步完成，无需PCR后处理，整个检测过程可在1 h内完成。采用TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与套式PCR同时对276份临床虾样品的检测结果显示，对于EHP拷贝数低(小于100拷贝/mg)的样品，TaqMan-MGB探针荧光定量PCR比套式PCR具有更高的灵敏度，总阳性检出率提高2.6 %(多检出7份)。可见，基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，不仅能满足临床上对EHP进行快速定量检测的需求，还能提高EHP低感染水平如早期感染或潜伏感染的阳性检出率，对控制EHPD的传播与扩散具有重要意义。

本研究对近年广西养殖虾类样品的检测结果表明，2019年EHP阳性检出率(30.6 %)较2018年(16.2 %)约增加一倍，且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾、克氏原螯虾和红螯螯虾均有检测到EHP阳性，在临床上表现出生长缓慢或停滞的虾几乎都能检测到EHP，说明EHPD已成为危害广西养殖对虾主要疫病之一。但由于EHP感染不直接导致虾类死亡而易被忽视，且EHP感染数量与其危害呈正相关，因此加强虾类养殖过程中EHP感染强度的实时监测，可为制定相应的防控措施提供重要依据。基于TaqMan-MGB探针建立的荧光定量PCR符合当前养殖生产中对EHP高灵敏定量检测技术的需求，将在亲虾筛选、苗种检疫、疫情监测等各养殖环节中发挥重要作用。

4 结 论

基于TaqMan-MGB探针建立的EHP荧光定量PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，适用于虾类样品的EHP定量检测，可为EHP实时监测及EHPD快速诊断提供一种新的技术手段。