龙眼Myb-related-R1的克隆及生物信息学分析

李浩然 徐炯志 潘介春 王颖 李琳 王金英 黄幸 谭春露 邓英毅

摘 要：目的：以龙眼成熟叶片为试验材料，研究Myb-related基因在龙眼中的表达情况，初步推出侧该基因的功能。方法：通过转录组测序及生物信息学分析得到龙眼Myb-related R1基因全长序列，进一步设计特异引物对其开放阅读框（ORF）全长序列进行克隆和生物信息学分析。结果：Myb-related-R1基因与SANT超家族基因片段有相似之处，ORF长度为879bp，编码292个氨基酸，有1个Myb结合位点。该蛋白属于非跨膜亲水蛋白，亚细胞定位预测定位于细胞核，存在35个氨基酸磷酸化位点。其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，二级结构与三级结构预测结果高度一致，同源基因进化树分析表明，该基因与阿月浑子蛋白组亲缘关系最近。结论：根据其他物种该基因的功能及生物信息学软件预测结果，可初步推测该基因功能与染色体端粒结构有关，且与花青素合成有关。

关键词：龙眼;基因克隆;Myb-related-R1;端粒

中图分类号 S667.2文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）09-0012-06

Cloning and Bioinformatics Analysis of Myb-related-R1 in Longan

Li Haoran et al.

（1Collegeof Agriculture，Guangxi University，Nanning 530004， China）

Abstract： Objective： the Myb-related gene family has different functions in plants.In this study， the expression of this gene in the mature leaves of longan was studied， and the function of this gene was derived.Methods： the full-length sequence of longan Myb-related-R1 gene was obtained by transcriptome sequencing and bioinformatics analysis， and further specific primers were designed for cloning and bioinformatics analysis of the full-length sequence of open reading frame （ORF）.Results： the Myb-related-R1 gene is similar to the SANT superfamily gene fragment.The length of ORF is 879bp， encoding 292 amino acids， and there is a Myb binding site.This protein belongs to non-transmembrane hydrophilic protein， which is located in the nucleus by subcellular localization prediction and has 35 amino acid phosphorylation sites.The secondary structure was mainly composed of ml-helix and irregular curl， and the predicted results of the secondary structure and tertiary structure were highly consistent.Conclusion： according to the function of this gene in other species and the prediction results of bioinformatics software， it can be preliminarily speculated that the function of this gene is related to telomeres and anthocyanin synthesis.

Key words： Longan;Gene cloning ; Myb-related-R1;Telomeres

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国南方果树，俗称桂圆，是广西地区主要栽培的果树种类之一[1-2]。因品种结构不合理，导致国内龙眼產期集中、大小年明显等问题凸显，使我国龙眼产业在国际竞争中处于劣势。为了有效调节龙眼产期，提高生产效益，许多学者开展了龙眼成花机理、产期调节技术研究及其优良品种的选育[3]，对龙眼成花分子生物学的研究逐步成为人们关注的重点。

目前，已有大量的Myb-related基因从植物中分离出来，但只有少数基因的功能为人所知。在玉米中，有3种Myb-related基因（Cl、Pl和P）是黄酮类化合物和衍生色素形成所必需的[4-5]。花青素是植物的二级代谢产物[6]，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一，RVE8可以直接与花青素生物合成中所涉及的启动子基因相关联，并在响应昼夜变化过程中调控这些基因的表达，RVE被认为是植物中花青素生物合成的昼夜节律调节因子[5，7]，而且花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播，对植物成花及结果起着重要作用。可见，Myb-related-R1基因与植物色素的合成及开花等功能具有紧密联系。

植物转录因子MYB是近年来发现的一类转录因子，与调控植物生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程有关，是植物中最大的转录组家族之一[7]。大多数MYB蛋白在N端含有一段特定的氨基酸残基组成的MYB结构域，根据这个高度保守的结构域的结构特征，可将MYB转录因子分为以下4个亚类：1R-MYB/Myb-related;R2R3-MYB;3R-MYB;4R-MYB（4个R1/R2的重复）。Myb-related（1R-MYB）类基因家族为本研究的主要内容。只含1个R结构域的MYB转录因子亚类，单一R结构的MYB蛋白可存在于肽链的两端或中间，该类蛋白是重要的端粒结合蛋白，其主要作用是集中维持染色体结构的完整性，但在调节基因转录过程也发挥一定的作用[9]。通过系统进化树将Myb-related基因家族分为以下5个高度保守的亚家族：CCA1-like/R-R、TBP-like、CPC-like、I-box-like和TRF-like;各亚家族的结构非常保守。其中TRF-like亚家族数量非常之少，说明它们在进化过程中非常保守。

干旱是影响植物生长和生理的主要环境胁迫因子之一，相应地，为应答干旱胁迫，植物会启动一系列应答机制来抵御外界环境因子。玉米Myb-related基因的表达水平在耐旱品种和非耐旱品种间存在差异，它们的表达谱很相似。其中，4个CCA1/R-like基因（ZmMYBR19，ZmMYBR28，ZmMYBR49，和ZmMYBR56），1個TRF-like基因（ZmMYBR41）和6个TBP-like基因（ZmMYBR07，ZmMYBR26，ZmMYBR31，ZmMYBR45，ZmMYBR47和ZmMYBR55）的表达明显受到干旱的诱导，说明它们可能参与植物抗旱胁迫的应答。本研究从龙眼中获得Myb-related-R1基因，并通过生物信息学分析，进一步了解该基因理化特性，为进一步研究该基因功能及蛋白互作等提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料 供试材料为龙眼的成熟叶片，样品采自广西大学农学院标本园实验基地的成熟。采摘清洗干净包装后，液氮速冻带回实验室，-80℃冰箱中保存备用。主要试剂有：植物RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，等均购于TaKaRa生物公司;送生物公司进行PCR引物的合成与菌液测序;氨苄青霉素（Ampicillin），购自广州生物工程有限公司;其他的常规化学试剂均为国产分析纯。主要仪器有：恒温培养箱、恒温水浴锅、-80℃超低温冰箱、-20℃低温冰箱、PCR仪、移液枪、凝胶电泳仪、凝胶紫外成像仪、超净工作台、电泳槽、收集管、紫外检测仪、培养皿、冷冻高速离心机、高温高压灭菌锅、恒温摇床等。

1.2 方法

1.2.1 龙眼叶片总RNA提取和cDNA合成 取约100～150g龙眼成熟叶片样品加液氮研磨，然后根据RNA提取试剂盒说明提取龙眼叶片总RNA，用紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，cDNA的合成采用cDNA逆转录试剂盒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 Myb-related-R1基因的获得 利用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物KLMyb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R1、KL Myb-related-R1 R2（表1）。试验过程以上述cDNA稀释2-3倍后的产物为模板，KL Myb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R1为引物，Prime STAR MAX premix（2X）（高保真酶）进行第1次PCR扩增，再以第1次扩增产物稀释2～3倍为模板，KL Myb-related-R1 F、KL Myb-related-R1 R2为引物，使用ExTaq酶体系扩增第2次。随后，用胶回收试剂盒回收与目的基因大小条带相符的基因片段，得到比较纯的目的基因，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认回收基因条带准确性。

1.2.3 Myb-related-R1基因的克隆与测序 将Myb-related-R1基因回收产物经PCR检测后，将其连接到pMD18-T载体上，稀释1倍后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，摇床培养，涂板于已添加氨苄抗生素（100mg·L-1）的LB固体培养基，37℃培养15～18h后随机挑选阳性克隆菌，扩繁菌液并使用通用引物MF47和MR48进行菌落PCR检测阳性克隆，将检测条带大小正确的菌液送生物公司测序。

2 结果与分析

2.1 Myb-related-R1基因ORF的克隆 以龙眼cDNA为模板，用在线设计引物经PCR扩增的产物，通过琼脂糖凝胶电泳检测得到900bp左右的扩增片段（图1a），回收目的片段与PMD18-T载体连接，大肠杆菌菌液培养，再次通过菌液PCR验证后，跑胶并提取目的基因得到900bp左右的基因片段（图1b）。对阳性克隆菌进行测序分析，结果显示，该基因ORF全长879bp，编码292个氨基酸（图2）。

2.2 Myb-related-R1基因生物信息学分析

2.2.1 Myb-related-R1基因生物信息学分析 NCBI ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线分析Myb-related-R1的开放阅读框，用ExPASy ProtParam tool在线工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析Myb-related-R1的理化性质，通过在线软件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对蛋白保守结构域预测分析，通过NCBI-BLAST工具与其他物种氨基酸序列进行比对分析，利用在线分析工具SignalSignalP 4.1 Server（http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）在线工具对Myb-related-R1蛋白进行信号肽分析，利用在线软件TMHMM Server.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测Myb-related-R1蛋白的跨膜螺旋区，用植物亚细胞定位预测在线分析工具PSORT II Prediction （https：//psort.hgc.jp/form2.html）进行亚细胞定位分析，利用磷酸化位点在线预测工具NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白的磷酸化位点，利用在线分析工具Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测该蛋白二级结构，使用Phyre 2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在线工具预测蛋白三级结构，利用MEGA5.0采用邻近相接法（neighbour joining）步长值1000构建系统进化树，利用DNAMAN V6软件进行同源基因的多重序列的比对。

2.2.2 Myb-related-R1 编码蛋白质理化性质预测及分析 利用在线软件ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测和分析龙眼Myb-related-R1编码的蛋白质理化性质，结果显示，该蛋白质的分子式为C1359H2190N406O 438S8，原子總数为4401，相对分子量为31481.28Da;由292个氨基酸构成。理论等电点pI为6.99，脂肪指数78.49，总平均亲水性预测为-0.451，属于亲水蛋白，不稳定指数为68.76，属于不稳定蛋白。

2.2.3 Myb-related-R1 蛋白保守序列结构域预测与分析 通过在线软件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对Myb-related-R1蛋白保守结构域预测分析，表明该蛋白和SANT-superfamily有类似域架构，类似结构部分的超家族序列结合端粒DNA串联重复序列，对于含有富含G/C基序的重复序列，结合依赖于序列[C2-3 A（CA）1-6]。该结构域也存在于调控转录抑制复合物中，与DNA结合;还存在于调节性转录阻遏物复合物中，也与DNA结合。由此可知，该基因其功能区域可能与端粒结构的功能有关，亦可能与调节性转录阻遏物复合物的功能有关。

2.2.4 Myb-related-R1蛋白质信号肽、跨膜结构及亚细胞定位的预测 使用信号肽在线分析工具SignalSignalP4.1 Server（http：//www.detaibio.com/tools/signal-peptide.html）对Myb-related-R1蛋白进行分析，结果显示该蛋白为非分泌型蛋白。利用在线软件TM-HMM-2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测Myb-related-R1蛋白的跨膜螺旋区，未发现跨膜螺旋区，表明该蛋白为非跨膜蛋白。通过在线分析工具PSORT II Prediction （https：//psort.hgc.jp/form2.html）进行亚细胞定位分析，结果显示该蛋白定位于细胞核，由此可推断，Myb-related -R1转录因子定位于细胞核。

2.2.5 Myb-related-R1蛋白质磷酸化位点预测 利用在线预测工具NetPhos3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析龙眼Myb-related -R1蛋白的磷酸化位点，结果显示（图4），该蛋白由35个氨基酸磷酸化位点（阈值>0.5）构成，其中26个丝氨酸（Serines）磷酸化位点，7个苏氨酸（Threonine）磷酸化位点，2个酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位点，由此推测Myb-related-R1蛋白活性的调控与磷酸化作用有关系，且在龙眼Myb-related-R1蛋白中发生磷酸化修饰时以丝氨酸磷酸化位点为主。

2.2.6 Myb-related-R1蛋白质二级结构与三级结构预测分析 利用蛋白二级结构在线分析软件Prabi（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）对龙眼Myb-related-R1基因进行分析，结果表明龙眼Myb-related-R1蛋白二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成，α-螺旋占18.84%，延长线17.81%，β-折叠占3.08%，无规则卷曲占60.27%。

通过Phyre 2 （http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）在线工具预测Myb-related-R1蛋白三级结构，结果表明，该蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成（图5）。

通过蛋白进化树结果预测结构最为相似的4个物种的蛋白三级结构，结果表明，荔枝Litchi chinensis MK648002.1蛋白结构与龙眼Myb-related-R1蛋白结构相似度最高，Pistacia vera 阿月浑子XM_031394999.1和Citrus clementina（克莱门氏柑橘）XM_006439654.2蛋白结构相似较高。虽然阿月浑子与Myb-related-R1进化树亲缘关系最近，但三级结构比对中，荔枝与龙眼的相似度最高，故该基因功能极有可能一致。

2.2.7 Myb-related-R1蛋白质进化树构建和多重序列比对 通过MEGA 4.1软件Myb-related-R1氨基酸序列与 NCBI中一致性较高的11种植物序列进行系统进化分析（图6），结果表明，Myb-related-R1与阿月浑子（Pistacia vera XM_.31394999.1）的亲缘关系较近，蛋白结构决定功能，可初步判定该两者基因功能有相似之处。

使用DNAMAN V6 软件进行同源基因的多重序列的比对（图7），结果显示，该基因含有Myb-related典型保守序列SHAQKYF[9]，确定该序列为Myb-related基因家族中的一员。

3 讨论

本研究利用得到的龙眼转录组数据库序列信息，筛选并结合克隆技术，成功地获得龙眼Myb-related-R1基因的ORF全长。通过生物信息学分析软件发现，Myb-related-R1属于MYB基因家族中的Myb-related亚家族，全长879bp，编码292个氨基酸，含有1个Myb-related保守结构域。分析结果表明，Myb-related-R1基因蛋白属于亲水蛋白，不稳定蛋白。通过在线软件NCBI-CDS对其蛋白保守序列预测分析发现，该蛋白与SANT-TRF超家族有联系，初步推测其功能与端粒结合因子有关，而端粒与染色体的完整性和细胞分裂周期关系密不可分。

通过在线软件NCBI-CDS（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对与Myb-related-R1基因亲缘关系最接近的Pistacia vera XM_.31394999.1阿月浑子蛋白保守结构域预测分析，发现该蛋白结构功能与Myb-related-R1功能预测结果相似，均具有端粒重复结合因子DNA结合域，故可预测该基因有起保护端粒免受DNA修复机制的破坏的作用，但在网络上仍未有该基因功能相关报导。

从拟南芥等模型植物研究中发现，Myb-related转录因子能够调控基因的表达参与植物生长发育全过程、维持植物体内初级代谢和次级代谢稳定、提高植物体对胁迫的抗逆性[10]且参与植物花青素的合成[11]，发现Myb-related转录因子与植物成花之间有着微妙的联系。鉴于Myb-related转录因子对龙眼成花的影响作用尚无相关报道，本着探索该基因家族在植物界中庞大的数量及其在植物体内的功能作用的目的，进行了龙眼Myb-related转录因子的克隆，并对其克隆后序列进行生物信息学分析，通过参考前人对Myb-related基因的研究进展，完善了Myb-related基因家族成员信息，进而为该基因家族后续研究提供理论依据。

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（责编：张宏民）