超高效液相色谱-串联质谱法测定葡萄酒中赭曲霉毒素A的方法的优化研究

赵天宇 ，杨 帛，刘锐萍，张 然，赵广西，杜 伟，李 军

（1.河北科技师范学院，河北秦皇岛 066000；2.秦皇岛市食品药品检验中心，河北秦皇岛 066000）

赭曲霉毒素（ochratoxin）是多种霉菌产生的次级代谢物，是一种真菌毒素。现已发现有7 种曲霉和6 种青霉菌能产生赭曲霉毒素，但大部分由纯绿青霉、赭曲霉和碳黑曲霉产生[1]。赭曲霉毒素分为赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)和赭曲霉毒素C(ochratoxin C，OTC)等。毒性最大、分布最广、对人体伤害最大的是OTA，主要毒性有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌等[2]。由于葡萄的生长环境和葡萄酒的酿制工艺等原因，经常会造成赭曲霉毒素的污染[3-4]。刘青等[5]对9 个国家中的11 种不同种类的葡萄酒进行筛查，OTA的检出率高达45.4%，检出浓度为1.1～11.5 μg/L，有4 个样本超过2 μg/L。我国GB 2761—2017 标准[6]和欧盟法规[7]规定OTA 在葡萄酒中的最大残留量为2 μg/kg。随着检测技术的不断发展，检测方法的精确度不断提高，同时为提高效率，也需要更加简单、高效的前处理方法。

目前应用于葡萄酒中OTA 的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法[8-9]与高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法[10-13]。前者的检测灵敏度高，设备普及，适合推广。后者的准确度高、灵敏度高、具有很高的可重现性，但其价格昂贵，检测成本高。在我国GB 5009.96—2016[14]标准规定了食品中赭曲霉毒素A 的检测方法，样品前处理主要采用固相萃取和免疫亲和柱法，前处理耗时太长，成本过高，并不适用于大批量葡萄酒样品的检测。QuEChERS 是一种集快速、简单、便宜、有效、可靠、安全于一体的前处理技术，目前广泛应用于农药、兽药残留的分析检测[15-17]中。近年来，也逐渐应用于真菌毒素的检测[18-21]当中。

本研究建立了一种利用UHPLC-MS/MS 法测定葡萄酒中的OTA 的方法，并基于QuEChERS 前处理方法对前处理进行优化。开发出无需净化的前处理方法，极大缩短了前处理时间，节约了成本，能满足大批量样品的快速检测需要。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：葡萄酒为昌黎产红葡萄酒。

试剂：OTA 标准品（CAS:303-47-9，10 μg/mL，pribolab），乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，甲酸铵、乙酸钠和无水硫酸镁均为分析纯。

仪器设备：超高效液相色谱（CBM-20A，日本岛津）-三重四级杆串联质谱仪（TRIPLE QUADTM 5500，美国AB）、ME204T 电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）、NP-30S 漩涡混合器（常州恩培仪器制造有限公司）、摩尔元素型Molecular1815d 超纯水机（重庆摩尔水处理设备有限公司）、Velocity14 离心机（英国Dynamica）、旋转蒸发仪（德国heidolph）。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液：以乙腈+甲醇（50+50）为溶剂配制1 μg/mL 的OTA 标准储备液，于-20 ℃冷冻保存，有效期为3个月。

标准工作液：将标准储备液稀释至100 ng/mL，并逐步稀释成标准曲线浓度1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL，现用现配。

1.2.2 样品前处理

准确移取2.5 mL 葡萄酒样品于50 mL 具塞离心管中，加入20 mL 乙腈、0.5 g 醋酸钠和2 g 无水硫酸镁。漩涡振荡3 min使其混匀，8000 r/min下离心10 min，取出上清液。残渣重复以上步骤，将两次所得上清液合并，在40 ℃下旋转蒸发至近干，剩余物质用乙腈-水（30+60）溶液2 mL 复溶，溶液过有机微孔滤膜（0.22 μm）后，留待仪器分析测定。

1.2.3 基质效应实验

将不含目标待测物的样品经上述前处理后作为基质空白，向基质空白中加入不同浓度的OTA标准溶液，通过基质标准曲线的斜率与纯溶剂配制标准曲线的斜率之比，来判定葡萄酒基质对OTA的增强或抑制作用。

1.2.4 线性范围、检出限（LOD）及定量限（LOQ）

向不含OTA 的基质空白溶液添加不同浓度的OTA 标准溶液，经有机微孔滤膜（0.22 μm）过滤后，MRM 模式检测，分析添加浓度与响应值的相关性，得到基质曲线。检出限和定量限分别为基质曲线的最低点浓度的3倍和10倍信噪比（S/N）。

1.2.5 回收率和精密度实验

向不含OTA 的葡萄酒基质中添加不同浓度的OTA 标准溶液，添加量分别为1 ng/mL、4 ng/mL 和10 ng/mL。经上述步骤处理、检测后，使用基质曲线定量，计算回收率和精密度。

1.2.6 仪器条件

色谱条件：色谱柱：Atlantis®T3（2.1×150 mm，3 μm）；柱温30 ℃；进样量20 μL；流速0.2 mL/min；流动相A 为1‰甲酸（含0.5 mmol 甲酸铵），B 为乙腈；洗脱条件见表1。

表1 色谱梯度洗脱条件

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子扫描。检测方式：多反应监测MRM；电喷雾电压（IS）：-4500V；雾化器压力（GSI）：30 Psi；气帘气压力（CUR）：25 Psi；辅助气压力（GS2）：30 Psi；离子源温度：500 ℃。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

配制浓度为50 ng/mL 的OTA 标准溶液，对其进行质谱扫描，优化质谱参数。通过调节去簇电压、碰撞气能量等参数观察目标化合物母离子和子离子碎片的响应情况。结果见图1、图2。根据响应最优原则确定各项参数的数值，结果见表2。

2.1.2 流动相的选择

表2 质谱分析参数

为提高化合物在离子源中的电离效率，通常会向流动相中添加挥发性酸和缓冲盐体系。少量的有机酸还能改善峰型。本实验分别采用乙腈-水体系、乙腈-水（1‰甲酸）体系、乙腈-水（0.5 mmol 甲酸铵）体系、乙腈-水（1 ‰甲酸、0.5 mmol 甲酸铵）体系进行对比，发现甲酸的加入可以有效改善峰型，甲酸铵的加入可以使基线分离，消除拖尾。考虑到仪器维护及清理的问题，甲酸和甲酸铵均添加在超纯水中。因此选用乙腈-1 ‰甲酸（0.5 mmol甲酸铵）体系。

2.1.3 洗脱梯度的优化

经实验发现，梯度洗脱时有机相浓度低时会导致OTA 洗脱不彻底，会对基线和下一针样品结果出现影响。当梯度洗脱有机浓度达到95 %时，能缩短洗脱时间，洗脱效果最好，见图3。

2.2 前处理方法的优化

葡萄酒为液体，样品与溶剂的体积比会对萃取效率产生显著的影响。在样品中添加10 ng/mL 的OTA 标准溶液，并以2 倍、3 倍、5 倍、8 倍、10 倍样品体积的乙腈作为提取液进行前处理，经UHPLCMS/MS 测定后，将所得峰面积与相同浓度的OTA标准品峰面积进行比较，回收率结果见表3。回收率随体积比的增加而增加，当达到8 倍体积比时达到89 %，继续增加乙腈用量，回收率不会继续上升。本实验选取C18固相萃取填充料对样品进行净化处理后发现，标准物质的回收率并没有比直接用乙腈提取上样高。综合效率及成本等考虑，本实验选择直接用乙腈提取上样。

表3 不同体积比下OTA回收率

2.3 基质效应评价

基质曲线与纯溶剂配制标准曲线相比，斜率比值为0.289，基质效应明显。因此，定量分析时选用基质曲线既可以提高定量分析准确性又可以保证定性离子的准确性。

2.4 方法的线性范围、检出限（LOD）及定量限（LOQ）

赭曲霉毒素A 在1.0～50.0 ng/mL 范围内有良好的线性关系，线性方程为y=3079.85058x+16392.92319，相关系数（r）为0.99971。检出限LOD为0.029 μg/mL，定量限LOQ 为0.098 μg/mL。远低于规定的最高限量（2 μg/kg）。

2.5 方法的回收率及精密度

以国标中OTA 的最大残留限量（MRL）为依据，选择分别添加1.0 ng/mL、4 ng/mL 和10 ng/mL浓度作为方法的回收率实验。每个加标实验重复6次平行，计算相对标准偏差评价精密度，见表4。

表4 OTA的回收率与精密度

2.6 样品测定

选取20 个昌黎本地红葡萄酒为酒样，使用本方法对OTA进行测定，并无OTA检出。

3 结论

本试验建立了一种基于QuChERS 的前处理方法，从提取方法、溶剂和流动选择、流动相等方面对方法进行了优化。结合UHPLC 串联三重四级杆质谱MRM 模式检测的检测方法，对基质效应进行了验证，并对仪器条件进行了优化，在保证回收率的前提下大大缩短了前处理的时间和节约了成本，出峰时间稳定在3 min 左右。本方法前处理简单、快速、灵敏度高、成本低，具有良好的可重现性，方法回收率均能达到94 %以上，检出限0.029 μg/mL。该方法可以满足GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》标准中赭曲霉毒素A 的检测要求，为葡萄酒安全检测工作提供了一种简便、快捷、准确的检测方法。