葡萄多种群种间杂种后代抗病性特征研究

乔改霞，王荣，刘玉娟，曾继娟，徐美隆1,，谢军1,，范培格*

（1. 中国科学院植物研究所，北京 100093；2. 宁夏林业研究院/种苗生物工程国家重点实验室，宁夏银川 750004；3. 宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；4. 中国葡萄酒产业技术研究院，宁夏银川 750021）

抗性育种中抗病育种是人们一直追求的育种目标，尤其是在欧洲和美洲国家。霜霉病是世界上最严重的真菌病害之一，而白粉病几乎存在于所有的酿酒葡萄产区[1]。黄宏娟[2]研究表明，感染白粉病的葡萄酿制的酒具有苦味和其他不良风味；而霜霉病会导致叶片光合性能下降，严重的会造成早期落叶，从而使葡萄营养不足，降低葡萄果实的成熟度[3-4]。美洲种葡萄是抗病性较强的种质资源，能抗多种真菌病，同时也具有较强的抗寒性能，但其具有的浓烈狐香味，以及青草味等，酿出的酒不易被接受[5-6]。山葡萄能耐-40 ℃低温，是葡萄属中最抗寒的种，对白粉病、白腐病等真菌病害抗性强，但不抗霜霉病[7]。欧亚种葡萄虽然具有较好的果实品质特性，但抗寒性及抗病性较差[8-9]。

宁夏贺兰山东麓产区是我国集中连片面积最大的葡萄酒产区，但当地极端的大陆性季风气候条件下，休眠季干旱寒冷，生长季雨热同季，导致欧亚种酿造品种冬季需要埋土防寒，夏季需要喷施大量化学农药，已成为阻碍葡萄与葡萄酒产业健康发展的重要瓶颈。因此，选育、种植抗逆的适宜品种是解决这一瓶颈问题的最有效途径。抗寒旱品种选育一直是我国酿酒葡萄选育的重要方向，利用抗寒性极强的山葡萄为亲本已选育出了一些优良品种，如‘北红’‘北玫’等欧山杂种。但这些品种在雨热同季的气候条件下也会感染霜霉病等病害。如何在选育抗寒旱新品种的同时，引入抗病基因是当前我国抗逆育种需要解决的问题。

本研究以含山葡萄血统的欧山杂种与含有河岸葡萄（V. riparia）、美洲葡萄（V. labrusca）、欧亚种葡萄（V. vinifera）血统的杂种后代进行杂交获得的多种群杂交群体后代典型株系为材料，分别以欧山杂种‘北玫’（V. vinifera×V. amurensis）、‘北红’（V. vinifera×V.amurensis），欧美杂种‘威代尔’（V. vinifera×V.labrusca），欧亚种‘贵人香’（V. vinifera）为对照，进行抗病性研究，旨在根据其抗病特点，提出育种方向及亲本选择的可行性，为抗病育种提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料：中科院西北生物中心平吉堡基地露地越冬的4年生含山葡萄、河岸葡萄、美洲葡萄、欧亚种葡萄血统的多种群杂交后代05-1群体，它们是以‘北红’为母本，‘7-11-49’[（Minnesota 78（Beta×Witt）×V.riparia）×V. vinifera]为父本杂交而来。同地块的2个欧山杂种‘北玫’‘北红’以及1个欧美杂种‘威代尔’和1个欧亚品种‘贵人香’为对照，共计20个种质。

1.2 种植情况

试材采用‘厂’字形树形，行距3.0 m，株距1.0 m。栽培管理一致。冬季不埋土。

1.3 试验方法

1.3.1 霜霉病鉴定

（1）田间自然鉴定。于2019年8月在葡萄霜霉病发生稳定期对各种质葡萄霜霉病发生情况进行调查，选取枝条顶端第5～14片共10片叶进行观测。每个种质调查10个枝条，共100片叶。

霜霉病病情调查采用Desaymard分级法[10]：

根据叶片病斑面积占全叶面积百分率（R）划分病级：0级：全叶无病斑R＝0；1级：0＜R≤5%；2级：5%＜R≤25%；3级：25%＜R≤50%；4级：50%＜R≤75%；5级：R＞75%或叶片枯死。

（2）室内接种鉴定。采集新鲜葡萄叶片，用无菌水冲洗掉表面的灰尘，将病菌配成浓度为1×105个/毫升的孢子囊悬浮液，喷雾接种到感病葡萄离体叶片背面进行繁殖，叶柄用润湿脱脂棉包裹保湿，置于底部垫有琼脂培养基的培养皿中，封口保湿。22～28 ℃培养4～7 d，收集新鲜病原菌用于抗病性评价。

采集每个葡萄种质枝条顶端第4～6节位的健康新鲜叶片，用自来水冲洗干净，并吸干水分，再用75%的酒精灭菌20 s，1%的次氯酸钠溶液灭菌5～7 min，无菌水冲洗3次后，用直径为1 cm的打孔器在叶片背面画圈，每个重复5片叶，叶背朝上放入有琼脂培养基的培养皿中，喷雾接种浓度为1×105个/毫升的孢子囊悬浮液，在密封保湿、25～28 ℃、每天光照12 h条件下培养。接种7 d后调查发病情况。每个处理采样15片叶。

1.3.2 白粉病鉴定

于2019年9月在葡萄白粉病发生稳定期对各种质葡萄白粉病发生情况进行调查，叶片选样、分级及计算方法与霜霉病田间调查方法相同。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2017软件进行数据处理与分析；SPSS 21.0软件进行方差分析和聚类分析，Origin辅助作图。

根据以下公式计算病情指数，通过病情指数分析不同葡萄品种对霜霉病及白粉的抗感病情况。

病情指数＝∑（感病极值×该级发病叶数）/（调查总叶片数×最高感病级别）×100

品种反应型按照国际植物种质委员会（IBPGR）的标准将其分为5级[11]：免疫（I）：病情指数：0；高抗（HR）：病情指数≤5；抗病（R）：5＜病情指数≤25；感病（S）：25＜病情指数≤50；高感（HS）：50＜病情指数≤100。

2 结果与分析

2.1 不同葡萄种质田间霜霉病鉴定

田间调查结果表明（表1），供试的20个葡萄种质的叶片发病率差异较大，‘贵人香’叶片发病率最高，95%的叶片感染霜霉病，其次是‘05-2-12’，有89%的叶片感染霜霉病，‘05-1-144’发病率最低，仅有2%的叶片感染。病情指数反映种质间感病性的差异，根据霜霉病病情指数将供试种质大致分为4类：‘贵人香’的病情指数为66.03，属于高感品种；‘05-2-12’病情指数为45.53，属于感病类；‘05-1-17’‘05-1-133’‘北红’‘北玫’‘威代尔’等10个种质病情指数在5～25，属于抗病类；‘05-1-444’‘05-1-247’‘05-1-220’等8个优系病情指数小于5，属于高抗类。

2.2 不同葡萄种质室内接种霜霉病鉴定结果

通过20个葡萄种质的室内霜霉病抗性鉴定（表2）结果表明，各种质接种后对霜霉病的抗逆性存在明显差异。‘05-1-247’抗性最强，‘05-1-444’次之，属于高抗品系。‘05-1-323’‘05-1-133’等9个优系病情指数在5～25，属于抗性类别；‘05-1-76’‘北红’‘北玫’‘威代尔’‘贵人香’等9个种质，病情指数在25～50，属于感病类别。方差分析结果表明：‘05-1-247’与‘05-1-444’2个优系之间无显著差异，抗性较强；‘贵人香’‘北红’‘北玫’‘威代尔’等8个种质之间存在显著差异，且‘05-1-586’‘贵人香’与其它18个种质之间也存在显著差异，抗性最弱。

2.3 不同葡萄种质田间白粉病鉴定

田间白粉病鉴定结果（表3）表明，供试的20个葡萄种质田间白粉病的发病率和病情指数差异显著，尤其是群体优系的抗性表现从免疫到感病出现了极大的分离。‘05-1-76’‘北玫’‘威代尔’等7个种质田间无白粉病发病，对白粉病为免疫级别；‘贵人香’‘北红’‘05-1-155’等9个种质，病情指数小于5，属于高抗品种；‘05-1-12’病情指数为11.37，属于抗性类别；而‘05-1-87’‘05-1-220’‘05-1-323’3个优系，病情指数在25～50，属于感病类别。免疫优系‘05-1-76’发病率为0，而感病优系‘05-1-323’发病率高达74%，优系间对白粉病的抗性差异较大。

2.4 不同葡萄种质对霜霉病田间和室内接种抗性反应的聚类分析

根据20个葡萄种质对田间霜霉病的抗性反应进行了聚类分析。结果如图1所示，当欧式距离系数为15时，不同葡萄种质对霜霉病田间抗病性可划分为4类。第一类：抗性较强，包括‘05-1-444’‘05-1-247’等13个种质，病情指数为0.40～10.04；第二类：抗性中等，包括‘威代尔’‘05-1-323’‘05-1-62’‘北红’‘05-1-87’共5个种质，病情指数为12.43～24.60；第三类：感病类别，只有‘05-2-12’，病情指数达45.53；第四类：高感病类别，‘贵人香’病情指数高达66.03。

同时，对霜霉病室内的抗性结果进行了聚类分析。结果表明，当欧式距离系数为12时，可以将20个种质划分为4类（图2）。第一类抗性较强，病情指数在1.33～12.88，如‘05-1-247’‘05-1-17’等9个种质；第二类抗性中等，病情指数为19.6～21，如‘05-1-155’‘05-1-133’；第三类表现感病，病情指数为28.12～34.98，包括‘05-1-87’‘05-1-62’等7个种质；第四类为感病较强，病情指为42，如‘05-1-586’和‘贵人香’2个种质。

表2 不同葡萄种质室内接种霜霉病调查情况Table 2 Investigation of downy mildew in different grape germplasms

2.5 不同种质对白粉病田间抗性反应的聚类分析

根据20个葡萄种质对田间白粉病的抗性反应进行了聚类分析（图3）。当欧式距离系数为10时，可将20个种质分为4类。第一类抗性较强，包含‘05-1-76’‘北玫’‘威代尔’等7个免疫种质，病情指数为0，也包含‘贵人香’‘北红’‘05-1-155’等9个种质，病情指数均小于3.57，均为抗性较强种质。第二类抗病中等，只有‘05-1-12’，病情指数为11.37；第三类为感病种质，有‘05-1-87’‘05-1-220’，病情指数为25～30；第四类为高感病种质，只有‘05-1-323’，病情指数为48.8。

3 讨论与结论

宁夏贺兰山东麓产区是我国集中连片面积最大的葡萄酒产区，截止到2017年底，葡萄总面积达4.3万 hm2，其中酿酒葡萄3.8万 hm2[11]。由于贺兰山东麓主要为大陆季风性气候，生长季与雨季同季[12]，且主栽品种是‘赤霞珠’‘美乐’等欧亚种[8]，它们一般不抗霜霉病[13]，在大面积单一种植的同时，加剧了病虫害的发生。目前，葡萄霜霉病和白粉病是贺兰山东麓产区的主要病害，每年夏季的大面积爆发严重降低了葡萄的产量和品质，使种植效益受到极大损失[14]。虽然利用更新栽培技术、生物防治等方法来预防葡萄病害，也取得了不错的效果，但是选择和推广抗病性强的品种才是保证产业得到可持续发展的有效手段[15]。

葡萄杂交育种是综合利用亲本的优良基因培育新品种的基本方式。为了选育优质、抗旱寒或者抗病的新品种，双亲必须具有优质、抗旱寒或抗病的特性[16]。

表3 不同葡萄种质田间白粉病调查Table 3 Investigation of powdery mildew of different grape germplasms in field

Boubals[17]系统地研究葡萄属植物对白粉病的抗性，认为北美种群中的美洲葡萄、河岸葡萄抗性最强；在17世纪时，美国育种专家利用抗寒抗病的美洲葡萄与欧洲品种杂交，先后获得了抗逆性强的‘康克’‘卡托巴’等品种[18]；在19世纪时，法国育种家就利用抗病性较强的美洲种或美洲种与欧亚种葡萄杂交，育成了一批抗霜霉病和白粉病能力强，酿酒品质与欧洲品种相当的新品种，如‘Bronx’‘Castets’等[18]。通常，抗病的欧美第一、二代杂种具有强烈的狐臭味，所酿的葡萄酒不易被接受，现代育种家通过与欧洲种回交的方法，来提高其酿酒品质。如美国纽约州农业试验站培育成的新品种‘Cayuga White’‘Lakemont’等就具有较好的抗寒、抗病性能，且具有优良的酿酒品质[19]。山葡萄是葡萄属抗寒性最强的种，20世纪初，中国育种家开始利用山葡萄作为抗寒育种的亲本，选育出了多个抗逆性和品质较好的品种，如‘北醇’‘北红’‘北玫’等[16]。山葡萄没有强烈的不良味道，有很好的酿酒特性，但山葡萄及其杂种抗病性，尤其是抗霜霉病的特性远不如美洲血统葡萄品种[7]。因此，引入抗病性较强的美洲血统葡萄杂种后代可丰富抗病基因，选育出既抗寒旱又抗病的新品种。

本研究结果也证明了这一点，16个多种群杂交后代优系在田间自然条件下有15个优系表现为抗霜霉病，室内接种条件下有11个优系属于抗性类型，‘北红’‘北玫’‘威代尔’田间表现抗病，但室内接种表现感病，欧亚种‘贵人香’无论是田间自然条件还是室内接种条件均表现不抗，而杂种优系表现出较强的抗霜霉病性能。对白粉病抗性方面，有5个优系表现为免疫，7个表现为高抗，1个表现为抗。可以说多数优系表现出优异的抗病性能。

可见，进行不同抗逆基因多种群的杂交，可提高杂种后代的复合抗逆性，引入含美洲原产野生种高抗病基因，可以在山葡萄杂种后代高抗旱寒的基础上，增强抗寒性能，提高抗病性。