CRISPR/Cas9技术及其在胰腺癌研究中的应用进展

庄云英，张海燕 综述 曾清芳 审校

胰腺癌是消化系统肿瘤中恶性程度较高的一种，具有较高的病死率。据统计，2019年美国有56 770例胰腺癌新病例和45 750例胰腺相关死亡病例，与其他常见的癌症相比，胰腺癌的患者预后一直未得到明显改善，5年相对生存率仅为9%[1]。尽管国内外各个科研团队在探究胰腺癌更好的治疗策略方面已经付出了相当大的努力，如靶向治疗、免疫治疗和潜在的规律成簇的间隔短回文重复序列(clusteredregularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) 相关蛋白9(RISPR/Cas9)定向基因治疗等，但手术、放疗和化疗仍然是当前临床上胰腺癌的主要治疗方法。

目前，RISPR/Cas9已经成为一种强大的基因编辑工具，并在精准医疗领域具有潜力。CRISPR重复序列最早由Ishino等[2]在1987年发现，随后在2012年，Jinek等[3]的研究证明了一个内切酶可以被一个双RNA结构诱导直接切割目标DNA。从那时起，CRISPR/Cas9技术迅速发展，并促进基础和临床研究取得了惊人的进展。与其他基因编辑技术相比，如巨核酸酶 (meganucleases，MNs)、锌指核酸酶 (zinc finger nucleases，ZFNs)、转录激活子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，CRISPR/Cas9技术成本更低、效率更高、应用更简单[4]。由于近年来CRISPR/Cas9技术在多个领域取得了突飞猛进的进展，笔者就CRISPR/Cas9及其在胰腺癌中的应用进行综述。

1 CRISPR/Cas9技术

有规则间隔的短回文重复聚类 (CRISPR)是Ishino等[2]在大肠杆菌中发现了一段高度保守的核苷酸序列，它位于同工酶转化碱性磷酸酶基因3’末端的侧边区域，表现为14 bp的二元对称。然而，直到2007年Barrangou等[5]将嗜热链球菌暴露于噬菌体中并对由此产生的抗噬菌体变体进行测序，人们才充分认识到CRISPR序列的功能和生物学重要性。对变异DNA的分析表明，这种细菌从噬菌体基因组中获得了的新的CRISPR间隔。随后，对细菌基因组中CRISPR序列的识别引出了一组称为CRISPR的同源基因和相关(Cas)基因的识别，它们共同组成了CRISPR位点。受到病毒感染插入CRISPR-Cas的细菌基因组表明，CRISPR-Cas可能提供对噬菌体的抗性，并能通过插入或删除间隔噬菌体序列，使感染的抗性增强或减弱。

Jinek等[3]在2012年首次证明了CRISPR- Cas系统可以产生成熟的CRISPR RNA (crRNA)和碱基对反式激活crRNA (trans-activating crRNA，tracrRNA)，共同形成双RNA杂交结构。这种双RNA结构能够将CRISPR相关蛋白Cas9引致特异性DNA序列，并在目标DNA中产生双链断裂[2]。2013年，Cong等[6]及Mali等[7]分别利用CRISPR/Cas9系统成功编辑了人EMX1、PVALB、PPP1R12C基因和小鼠Th基因的DNA序列。这是首次展示了CRISPR-Cas9系统编辑真核细胞基因组的能力。此后，大量的研究提高了基因编辑工具CRISPR/Cas9在不同物种中的特异性、正交性和多样性，并促进了其在生物组学中的应用和发展。

CRISPR/Cas9技术在动物模型的生成、基因功能研究、多路复用突变和染色体重排等方面得到了快速的推广和应用。与MNs、ZFNs、TALENs等传统编辑工具相比，CRISPR/Cas9技术具有成本更低、效率更高、更加简单的优点。

2 在胰腺癌研究中的应用进展

2.1 胰腺癌中CRISPR/Cas9的基因编辑 同源引导RNA可以引导Cas9核酸酶靶向基因组中的特定位点。当Cas9被引导到目标DNA序列，并且下游有一个前间隔序列相邻模体(protospacer adjacent motif，PAM)序列时，它将在该位置切断基因组的两条链。然后，细胞利用两种不同的机制修复断裂：(1)利用非同源末端连接修复途径进行不精确地修复，这会导致碱基的插入或删除；(2)通过同源导向修复途径进行准确地修复。基于现有的同源DNA序列，同源导向修复途径可以通过介导DNA序列交换过程，将提供的DNA序列作为修复序列插入到相匹配的断裂DNA中，从而准确修复DNA损伤。因而CRISPR/Cas9的敲除或敲入可通过诱导非同源末端连接或通过同源导向修复，删除、替换或添加基因序列来实现[8]。

CRISPR/Cas9系统在胰腺癌研究中被广泛用于敲除与疾病进展相关的基因。2018年Watanabe等[9]利用CRISPR/Cas9在人类胰腺导管腺癌细胞系中敲除了KDM6A基因，从而证明了KDM6A缺乏的细胞系呈现出高侵袭性的表型。2018年Pessolano等[10]及2016年Belvedere等[11]表明，在Mia PaCa2细胞系中利用CRISPR/Cas9定向敲除ANXA1基因，产生细胞外囊泡分泌变少和运动减弱的表型。Barkeer等[12]研究团队在敲除Capan1细胞系中的GALNT3基因后发现，细胞形成的微球体变少，并丧失了细胞自我更新、迁移的能力。2018年Chugh等[13]利用CRISPR/Cas9技术，将C1GALT1从PDAC细胞中敲除，发现细胞的生长、迁移、成瘤、转移、Tn 和sTn的表达增加。由此可见，敲除胰腺癌细胞特定基因相同策略的研究有很多，并且均观察到了不同表型的变化。总而言之，这些研究表明，CRISPR/Cas9是一种非常强大的基因编辑工具，可以用来探索胰腺癌的基因信号通路、增殖、迁移、侵袭和潜在的化疗耐药。通过利用CRISPR/Cas9技术敲除靶基因，观察其产生的表型变化的特点，我们可以更好地了解靶基因的生物学功能，识别胰腺癌潜在的治疗靶点或更好的治疗策略。而要使CRISPR/Cas9技术成为一种有效的临床治疗策略，还有很长的路要走。

近些年来，CRISPR/Cas9的基因敲除在探索肿瘤发生和发展方面也很重要，也常用于构建特异性基因表达的干细胞和动物模型，我们总结了2017-2019年的相关研究，见表1。尽管CRISPR/Cas9程序复杂，并且需要大量时间，但在胰腺癌的研究中，构建基因表达载体，并通过反转录病毒或慢病毒，将载体转译到细胞中从而生成特异性基因表达的细胞仍然很常见。

表1 使用CRISP/Cas9技术对胰腺肿瘤细胞基因敲除功能基因的研究相关

2.2 CRISPR在胰腺癌中的联合文库筛选 使用sgRNA(small guide RNA，sgRNA)文库进行功能缺失表型筛选是在特定生长条件下识别蛋白质新功能的一个有效方法。而CRISPR整合文库筛选的主要策略则是在一个CRISPR整合文库中包含数千个质粒，每个质粒带有一个特定靶基因的sgRNA。首先sgRNA需要通过慢病毒或反转录病毒转导进入足够数量的细胞，将被转导的细胞放在特定条件下培养，以便筛选出所需的表型。筛选后，分离、提取出细胞中的基因组DNA，并进行下一代测序。然后，将NGS数据映射到一个预编译的库中，其中包含基因特异性的gRNAs(guide RNAs，gRNAs)，并使用基于模型的全基因组CRISPR-Cas9敲除分析(model-based analysis of genome-wide CRISPR-Cas9 knockout，MAGeCK)等计算工具分析结果。最后，通过将对照组与所选gRNAs进行对比，识别与所观察到的表型相关的基因。

目前，已有一些研究在胰腺癌细胞中使用了CRISPR联合文库筛选。2019年，Bakke等[38]用人类sgRNA文库转染PANC1-Cas9细胞，并利用100nM的吉西他滨条件培养细胞6 d以进行筛选。在比较了吉西他滨选定样本和对照样组样本的NGS结果后，PSMA6被确定为最佳靶点并继续实验发现，抑制PSMA6可导致细胞凋亡和椭球体形成减少。2017年，Steinhart等[39]将TKO gRNA文库导入HPAF-Ⅱ-Cas9细胞，并在不同时间点筛选细胞，以确定细胞增殖所需的基因群。他们利用BAGEL算法计算每个基因的对数拜耳因子(log Bayer factor， BF)。这一分析确定了Wnt信号通路的几个核心成分，包括WLS、CTNNB1、TCF7L2、LRP5、PORCN，以及3个FZD受体，以及HPAF-Ⅱ增殖所必需的编码基因FZD5、WNT7B、WNT10A。随后，这些结果在AsPC-1和PaTU8988S细胞系中得到验证，并确定Wnt通路是胰腺癌细胞增殖的重要介质。这些筛选的结果也表明, RNF43突变的PDAC细胞的生存、增殖均选择性依赖Wnt-β-catenin信号。之后，在PATU8902和PATU8988T两种细胞系中进行了基因组规模的CRISPR-Cas9敲除筛选，通过敲除以确定在MAPKi环境下能够促进增殖或生存的基因[40]。他们将GeCKOv2文库转入PATU8902细胞，将Avana文库转入PATU8988T细胞。使用100 nM 的MEK1/2抑制剂曲米替尼处理PATU8902细胞，使用10 nM的曲米替尼处理PATU8988T细胞。两种细胞系在经过14 d的处理之后，分离基因组DNA并进行下一代测序。通过比较分析确定了CIC和ATXN1L，并通过在体实验表明，CIC和ATXN1L的缺失均可降低曲美替尼治疗的敏感性[41]。

这些研究成功地证明了在特定选择条件下利用CRISPR联合文库筛选可以识别新的基因功能，从而为识别胰腺癌细胞的治疗漏洞提供了一种非常强大的方法，并为新的治疗策略指明了方向。但也有特殊因素会影响筛选结果的准确性，根据文库的大小不同，需要转换不同数量的细胞来维持库的覆盖率。削弱选择条件可能提供更全面的结果，但同时也会产生假阳性，而并不完全是由表型变化所引起。不同的选择方法也可能导致实验的可变性。深度测序质量和数据分析工具的选择也将在筛选准确性方面发挥非常重要作用。因此，实验结果仍然需要使用正交方法进行验证。

2.3 CRISPR/Cas9基因治疗胰腺癌的现状 在胰腺癌的基因治疗方面，当前的研究进展包括基于基因的肿瘤细胞对化疗的增敏、免疫接种和过继免疫治疗[42]。但近年来，由于其安全性和有效性，CRISPR/Cas9基因组编辑方法已在多个胰腺癌研究中得到应用。CRISPR/Cas9基因治疗在体内、体外都有潜在的应用前景。在体外治疗中，细胞从体外分离并修饰，然后再移植回体内。在体内治疗中，基因材料可以直接注入体内。2015年Chiou等[43]通过逆行胰腺导管注射腺病毒Cre和慢病毒Cre载体建立了体内胰腺癌模型，这项技术可以为胰腺癌的治疗提供新的方法。因此，CRISPR/Cas9技术为单基因疾病、退行性疾病和HIV感染的治疗带来了巨大的希望，并且已经进行了多次CRISPR/Cas9的临床试验。然而CRISPR/Cas9技术用于胰腺患者的治疗仍有很长的路要走，仍尚存一些问题亟待解决，例如，哪个关键基因应该作为靶标?为了满足临床应用的需要，其准确性、效率和安全性如何提高？

CRISPR/Cas9不仅应用于胰腺癌的研究，还被广泛应用于其他癌症研究中，进而加深了我们对疾病进展的理解，耐药机制的识别，并发现潜在的治疗漏洞。然而，在临床应用CRISPR/Cas9之前，该技术仍有一些局限性需要认清。潜在的脱靶效应是一个不容忽视的问题，需要提高技术水平，尽量减少此类状况发生，以确保安全。目前，为减少偏离目标的影响，诸多团队已经作出了很大的努力。2013年，Ran等[44]将D10A突变的切口酶Cas9 (Cas9n)与一对与目标位点相对链互补的偏置sgRna结合。该方法在不牺牲目标切割效率的前提下，提高了CRISPR/Cas9编辑的特异性。2014年，Shen等[45]在小鼠成纤维细胞中，利用Cas9(D10A)、Cas9(H840A)进行AR-A和AR-B基因编辑，并采用T7EN裂解法和TA克隆法检测AR基因的修饰，未发现脱靶效应。2014年Tsai等[46]证明二聚体RNA引导的FokI核酸酶(RNA-guided FokI Nucleases，RFNs)可以识别扩展序列并高效编辑内源基因。

综上所述，针对当前临床对胰腺癌患者治疗的现状，CRISPR/Cas9正作为一种全新的工具和治疗手段正在被逐渐开发出来。在国内外诸多学者的研究中有了一定的成果，为下一步的研究指出了潜在的方向。而当前CRISPR/Cas9技术仍有一定的局限性，仅限于基础研究领域，距离临床应用还有一定的距离，许多问题都值得科研人员在后续的工作中去探讨和完善。