三七醇提物对秀丽隐杆线虫的降脂作用＊

黄 壮，李 静，杜鸿志，韩林涛，洪 怡，黄必胜，曹 艳

（湖北中医药大学药学院 省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室 武汉 430065）

三七[Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen]为五加科多年生草本植物，是我国传统名贵的中药材，药用部分主要为根茎，至今已有六百多年的用药历史。三七，味甘、微苦、性温，具有化瘀止血，活血定痛的功效。主治出血证，跌打损伤，瘀血肿痛。归肝经、胃经、心经、肺经、大肠经[1]。现代药理研究表明，三七具有活血止血、免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、降血脂等多种药理活性[2-4]。据报道临床使用中，三七单味药使用或与其他中药配伍使用，均表现出一定的降脂作用[5-6]。据动物实验及临床观察结果表明，三七有较为明确的降脂效果，但涉及其降脂作用机制的研究尚未见报道。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，简称C.elegans）属于线性动物门线虫纲，是一种全身透明，以细菌为食，广泛自由生活在土壤里的无脊椎动物。秀丽线虫体型小，生命周期短，后代繁殖量大，线虫可进行同步化处理，保持一致性，提高可比性；秀丽线虫是一个完整的生命体，有着简单但完善的神经系统、生殖系统，与人类基因有较高的同源性[7]。秀丽线虫的消化道由咽和肠两部分组成，是脂类物质沉积的主要场所，由于线虫虫体透明，在显微镜下可以很清楚的观察到从头部到尾部的整个肠道状况。因此，秀丽隐杆线虫作为研究脂肪代谢与分子机制的重要模型，符合动物实验3R 原则[8]，有着其他模式生物不可比拟的优势，目前秀丽隐杆线虫作为模式生物已广泛应用于脂质的代谢研究。线虫表皮和肠上皮细胞中存在多种脂质合成和催化酶，线虫主要在皮下和肠道细胞储存脂肪，可与脂质亲和性染料结合并被染色，如尼罗红、油红O 等染料，通过穿过线虫透明体的染料积累强度而量化线虫体内的脂肪[9]。其中，油红O 为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，进而着色，能较好的显示肠道内的脂肪滴。

本研究以秀丽线虫为模型，观察三七醇提物对线虫的寿命、运动行为、生殖等基本生命特征的影响；并采用油红O 对肠道脂滴进行染色，采用甘油三酯试剂盒法测定线虫体内的甘油三酯水平，以确定三七醇提物的降脂作用；采用RT-PCR 法检测脂肪代谢相关的基因，以探讨三七降脂的作用机制，为三七降脂产品开发提供参考。

1 试剂与仪器

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，野生型N2），大肠杆菌菌株（E.coliOP50），均由华中农业大学动科院胡敏教授惠赠。三七药材购于湖北强康中药饮片有限公司，琼脂糖（西班牙BIOWEST 公司），胰蛋白胨（英国OXOID 公司），油红O（上海源叶生物科技有限公司），绞股蓝总皂苷胶囊（亚宝药业集团股份有限公司），其他试剂均购于生工生物工程股份有限公司。

SPX-150B-Z 型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），IX-73P1F型荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS），荧 光 定 量PCR 仪（Roche，LightCycler 480II）,体式显微镜（南京江南永新光学有限公司）。

2 方法

2.1 样品制备

取适量三七经万能粉碎机粉碎后，采用筛分法过100 目筛，得三七粉。将三七粉加入5 倍量75%乙醇浸泡1 h，40℃超声提取4次，每次30 min，提取液合并，浓缩，真空干燥，得三七醇提物样品，置于干燥器中备用[10]，临用前用M9 缓冲液（适量Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4配制而成）溶解至所需浓度，并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。绞股蓝总皂苷胶囊作为阳性对照药，取10 粒（每粒含绞股蓝总皂苷60 mg），去囊壳，将囊心物用70%乙醇50℃温浸2 h，过滤，滤液回收乙醇至终体积为10 mL，4℃备用。

2.2 线虫同步化

用M9 缓冲液将产卵期线虫从固体培养基（简称NGM 板）洗下，静置3 min，吸走部分上清，留1 mL，加线虫裂解液1 mL，涡旋震荡5-8 min，3000rpm，快速离心2 min，吸走上清，加M9 液洗3-4 遍。25℃，M9 中放置过夜，即同步至L1期。

2.3 寿命实验

将同步化至L4 期的线虫分别置于含不同浓度三七醇提物的NGM 板中，终浓度分别为0 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL，每板线虫约50 条，在25℃恒温培养箱中培养，此时寿命计为day 0，每2 天观察并计数各组线虫的死亡数，并将存活线虫转至新板继续培养。线虫死亡评判标准为：无移动、无吞咽动作，且用珀金丝针轻触也无反应。

2.4 生殖实验

将线虫挑至空白板及各含药板中，每板1条，每组10 板，每24 h 将线虫转入新的NGM 中，直至排卵期结束。所有含卵板均在25℃孵育48 h 后再计数，各板孵出的子代线虫数目之和即该线虫总子代数[11]。

2.5 抗逆性实验

热应激实验：将线虫挑至空白板及各含药板中，于25℃培养，4 天后置于37℃培养，每小时观察并计数各组线虫的生存情况，至所有线虫全部死亡，线虫死亡评判标准同寿命实验[12]。氧化应激实验：将线虫挑至空白板及各含药板中，于25℃培养4天后，将线虫挑至含终浓度40 mmol/L 过氧化氢（H2O2）的96 孔板中，每孔10 条，每小时观察并计数各组线虫的生存情况，至所有线虫全部死亡，线虫死亡评判标准同寿命实验。

2.6 甘油三酯含量测定

将同步化至L4 期的线虫分组给药处理，每组约1000 条，4 d 后，分别用M9 缓冲液洗下，超声破碎提取甘油三酯，按照甘油三酯检测试剂盒说明书进行检测。根据标准曲线计算所含甘油三脂总量。

2.7 油红O染色

将同步化至L4期的线虫给药处理4 d后，用M9洗下，去上清，加入120 μL 多聚甲醛，混匀，置于4℃，20 min，再转至-80℃，15 min，固定后于40℃水浴解冻1 min，短暂离心去上清，用M9 缓冲液洗3 次，再加入油红O 染液120 μL，染色2 h，去上清，用M9 缓冲液洗3次，显微镜下观察拍照[13]。

2.8 脂肪相关的基因mRNA 表达水平测试

将同步化至L4 期的线虫给药处理4 d 后，破碎虫体,Trizol 法提取线虫总RNA，测定总RNA 的浓度及纯度后，在逆转录酶催化下合成cDNA，继而进行acs-2 mRNA、pod-2 mRNA、fat-5 mRNA 的RT-PCR 含量测定[14-15]。所用的引物序列：acs-2 mRNA 上游引物：5'-AGTGAGACTTGACAGTTCCG-3' ，下 游 引 物：5'-CTTGTAAGAGAGGAATGGCTC-3'；Pod-2 mRNA 上游引物：5'-TATGCGATGCCTGATGACTG-3'，下游引物：5'-TGTCTCCCAAACTGAACATAGC-3'；Fat-5 mRNA

图1 三七醇提物对秀丽线虫寿命影响的生存曲线（A）和平均寿命（B）

上游引物：5'-TGAACTGGACCCGAGTATTGA-3'，下游引物：5'-ACAGCCGAACTTCTTGCACT-3'。扩增结束后计算扩增效率，采用2-ΔΔCT法计算相对基因表达。

2.9 统计学分析

实验均重复3 次，用SPSS 21.0 软件分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用ONEWAY ANOVA 方差分析；数据以均数±标准差（x±s）表示，P＜0.05或P＜0.01表示有统计学差异。

3 结果

3.1 寿命实验

如图1所示，各给药组生存曲线均较对照组右移，表现出延长寿命的作用。与空白对照组相比，0.8 mg/mL组线虫的平均寿命延长13.69%（P＜0.05），最大寿命值为20 天；1.6 mg/mL 组线虫平均寿命显著延长22.07%（P＜0.01），最大寿命值为22 天。且给药组线虫的寿命随着给药剂量增加而延缓，呈现出剂量依赖关系。

3.2 生殖实验

通过对线虫给药后子代数的观察，发现三七醇提物对线虫子代总数无影响。如图2 所示，各给药组的子代总数目与对照组相比无显著差异(P＞0.05)，表明在0.8 mg/mL、1.6 mg/mL 剂量下，三七醇提物对线虫生殖能力均无显著性影响。

3.3 抗逆性实验

图2 三七醇提物对秀丽线虫生殖能力的影响

为了分析三七醇提物对秀丽隐杆线虫抗逆性的影响，分别开展了热应激实验和氧化应激实验。与对照组相比，热应激条件下，不同剂量的三七醇提物均能使线虫生存曲线右移，增强线虫的耐热能力，结果见图3。与对照组相比，三七醇提物0.8 mg/mL 剂量组线虫平均寿命增加了25.30%（P＜0.05），1.6 mg/mL 剂量组线虫平均寿命增加了40.05%（P＜0.01）。与对照组相比，氧化应激条件下，不同剂量的三七醇提物均能使线虫生存曲线右移，增强线虫的抗氧化能力，结果见图4。与对照组比较，三七醇提物0.8 mg/mL 剂量组线虫平均寿命增加25.77%（P＜0.05），1.6 mg/mL 剂量组线虫平均寿命增加了35.88%（P＜0.01）。由此可知，三七可显著增强线虫对热应激和氧化应激耐受能力，改善线虫的抗逆性。

3.4 甘油三酯含量测定

与对照组相比，不同剂量的三七醇提物均能使线虫体内甘油三酯含量下降，但仅高剂量给药组有显著性差异；阳性对照药1.0 mg/mL 绞股蓝总皂苷能显著降低甘油三酯含量，结果见图5。0.8 mg/mL 剂量组三七醇提物线虫使甘油三酯含量下降4.1%（P＞0.05），1.6 mg/mL 剂量组线虫使甘油三酯水平显著下降了8.9%（P＜0.05）。

3.5 肠道脂肪含量分析

图3 热应激条件下三七对秀丽线虫生存率的影响;

图4 氧化应激条件下三七对秀丽线虫生存率的影响

图5 三七醇提物对秀丽线虫总甘油三酯水平的影响

如图6 A 所示，油红O 将线虫肠道脂肪染为红色，颜色鲜艳并且容易观察，染色效果良好。对图片应用ImageJ 软件进行灰度分析，以量化数据。研究结果表明，用三七醇提物处理的线虫的脂肪沉积程度明显低于对照线虫。与对照组相比，阳性对照药1.0 mg/mL绞股蓝总皂苷处理的线虫肠道脂质含量下降了59.41%（P＜0.05），用三七醇提物处理的线虫在0.8 mg/mL 和1.6 mg/mL 剂量下的肠道脂质含量分别下降了21.20%和52.83%（P＜0.05）；高剂量组与阳性药比较无显著差异，表明两者效果相当（P＞0.05）。

3.6 对秀丽线虫脂肪代谢相关基因的影响

图6 三七醇提物对线虫体内脂质含量的影响

图7 三七对秀丽线虫体内的脂肪代谢相关基因表达水平的影响

为了初步探讨三七降脂作用的分子机制，研究三七对秀丽线虫脂肪代谢相关基因的影响，本研究检测了脂肪代谢相关基因的表达，见图7。与对照组相比，1.6 mg/mL 三七给药组线虫的pod-2、fat-5mRNA 表达水平分别下调了17.3%、35.1%、acs-2 mRNA 表达水平平均上调了11.4%（P＜0.05）。

4 讨论

在前期研究中，本实验通过不同剂量三七提取物的给药观察，发现三七提取物在2 mg/mL 以内是安全剂量[16]，故本实验剂量设计两个有效剂量，分别为0.8 mg/mL、1.6 mg/mL。

实验剂量的三七提取物对线虫的寿命有延长作用，而对产卵量没有显著影响，且能提高线虫抗热应激和抗氧化应激能力[17]，由此表明，三七是一种安全的、具有潜在开发价值的降脂药物。

本研究发现，三七可降低甘油三酯的含量，且呈现一定的剂量依赖。并观察了线虫肠道脂滴被染色情况，采用油红O 染色后，通过分析线虫肠道脂肪红光密度值变化，确定了三七醇提物能减少秀丽隐杆线虫脂肪沉积。这表明三七具有显著降低线虫肠道脂肪累积的作用，且随着三七浓度升高，线虫肠道脂肪含量逐渐降低。

为了探讨三七对秀丽线虫降脂的作用机制，采用了RT-PCR 分析方法对脂肪代谢相关的基因pod-2、fat-5、acs-2 mRNA 的表达水平进行了检测分析。机体内脂肪的调控是个复杂的过程，据报道基因acs-2是参与调节脂肪酸β-氧化的第一步；pod-2、fat-5 是参与脂肪合成的基因。acs-2 上调表示脂肪酸氧化增强，pod-2、fat-5 下调说明脂肪合成量减少[18]。由此可见，三七可通过对脂肪代谢相关基因的调节使秀丽线虫脂肪合成减少，降解增多，从而使体内脂肪累积减少。

生物体体内的脂肪贮存与利用一般是保持着动态平衡，机体在复杂的转录、翻译及后期加工上对脂肪代谢进行调控[18]。pod-2 编码乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl CoA carboxylase)，催化 乙酰辅 酶A（Acetyl CoA）变成丙二酰辅酶A（Malonyl CoA）是脂肪合成第一步。该类酶也是脂肪酸从头合成的限速酶；acs-2参与调节脂肪酸β-氧化的第一步；fasn-1、fat-5 是与脂肪合成有关的基因。三七醇提取能上调acs-2，下调fat-5、pod-2，故从基因表达水平可推断三七使线虫体内脂肪累积减少。脂肪代谢在机体生理和病理过程中都发挥着非常重要的作用，对长期的能量储存、细胞内及细胞间信号传导和维持细胞膜稳态都有重要的影响。过多的以甘油三酯（TAGs）形式的脂肪储存，将伴随着动脉粥样硬化和二型糖尿病等疾病的发生，而适度的脂肪储存则能延长寿命[19-20]，因此，保持脂肪代谢稳态对健康尤为重要。三七一方面表现出降低体内甘油三酯水平和减少肠道脂肪累积的作用，同时具有延长秀丽隐杆线虫寿命、增强抗逆性的作用，由此可推断，三七不仅有降低脂肪沉积的作用，还可能对机体脂肪代谢稳态具有较好的调节作用。

据前期文献报道，三七总皂苷对非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠表现出一定的降脂作用，其降脂作用机制跟其能够降低肝脏中一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）含量有关[3]。三七多糖对秀丽隐杆线虫具有延长寿命的作用[21]。但也有学者报道，三七总皂苷存对大鼠存在一定的亚慢性毒性作用[22]，因此三七总皂苷口服的安全性问题尚存争议[23-26]。三七醇提物中，含有多种化学物质，如三七总皂苷、总黄酮、总酚及多糖，发挥着多种药理作用，并且在一定的剂量下呈现较好的量-效关系，未表现出毒性。充分反映了中药的多成分、多靶点和整体性治疗特色[27]。但三七降脂的活性物质基础及其降脂作用尚待进一步阐明，尤其是可能存在的脂肪稳态调控的作用机制尚待深入研究。