大柴胡汤对2型糖尿病模型大鼠氧化应激致胰岛β细胞损伤的影响＊

崔艳荣，周 琦，朱向东＊＊

（1. 甘肃中医药大学中西医结合学院 兰州 730000；2. 嘉峪关市峪泉镇卫生院院 嘉峪关 735100）

2 型糖尿病（type 2 diabetesmellitus，T2DM）占糖尿病发病的90%[1]，持续高血糖与长期代谢紊乱等可导致全身各个组织器官的损害及其功能障碍和衰竭，严重影响患者的生活质量。氧化应激是引起2型糖尿病的发生及发展的重要因素[2]。研究表明氧化应激会引起胰岛β细胞功能损伤及外周组织胰岛素抵抗最终导致糖尿病的形成，严重者更会导致糖尿病神经病[3]、糖尿病视网膜病[4]和糖尿病心血管病[5]等多种并发症的形成。研究初步证实[6-8]，大柴胡汤通过改善糖代谢、改善胰岛素抵抗、增加外周组织对胰岛素的敏感性从而发挥治疗2型糖尿病的作用。本实验通过构建糖尿病大鼠模型探讨大柴胡汤治疗2 型糖尿病的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

自中国农业科学院兰州兽研所实验动物中心购买50 只SPF 级雄性SD 大鼠，7 - 8 周龄，体重（200 ±20）g，饲养于甘肃中医药大学综合楼实验室，环境温度（23.0±2.0）℃，相对湿度（35±5）%，换气量10-20次/h，日光灯采光，明暗交替，空白组常规充足饲料喂养，其他组给予高糖高脂饲料喂养，自由饮水，环境安静。实验动物合格证号：SYXK甘2015-0005。

1.1.2 主要药物及试剂

大柴胡汤制备：按原方柴胡八两，大黄二两，枳实四枚，半夏半升，黄芩三两，芍药三两，大枣十二枚，生姜五两，其中一两按15.6 g计算[9]称取饮片，8倍药量水浸泡30 min，加热煮沸，文火煎煮1 h，趁热过滤；按同法再煮1 次，合并2 次滤液，文火浓缩至含生药量1 g·mL-1。盐酸二甲双胍缓释片（0.5 g/片，正大天晴药业集团，20170616）；辛伐他汀片（20 mg/片，杭州默沙东制药有限公司，20170524）。

表1 各组大鼠FBG、HbA1c、TC、TG、FFA比较（± s,n = 8）

表1 各组大鼠FBG、HbA1c、TC、TG、FFA比较（± s,n = 8）

注：FBG，空腹血糖；HbA1c，糖化血红蛋白；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；FFA，游离脂肪酸；与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与辛伐他汀组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与二甲双胍组比较，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01；

FFA/(mmol·L-1)0.439±0.027 0.662±0.020**0.521±0.011△△0.575±0.128△△▲▲☆☆0.599±0.122△△组别正常对照组模型组辛伐他汀组大柴胡汤组二甲双胍组FBG/(mmol·L-1)4.900±0.622 24.850±1.348**19.400±1.268△△15.350±0.827△△▲▲14.250±1.245△△HbA1c/%2.200±0.141 11.875±0.478**10.525±0.350△△8.800±0.868△△▲▲8.350±0.420△△TC/(mmol·L-1)1.757±0.142 8.230±0.642**3.363±0.489△△7.002±0.356△△▲▲6.517±0.725△△TG/(mmol·L-1)0.810±0.127 5.273±0.267**2.583±0.189△△3.278±0.557△△▲3.690±0.557△△

链脲佐菌素（STZ）（美国Sigmag 公司，20180326）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）试剂盒（上海酶联公司）；Real-time PCR 试剂盒（美国Promega公司，0000229426）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备与实验分组

50 只雄性SD 大鼠适应性喂养3 天后随机选取10只作为空白对照组，给予普通饲料喂养。其余40只高糖高脂饲料（组成：67%大小鼠维持饲料+10%猪油+20%蔗糖+ 2.5%胆固醇+ 0.5%胆酸钠）诱导四周后腹腔注射链脲菌素（STZ）25 mg·kg-1造模，一周后再次注射STZ（25 mg·kg-1）。腹腔注射三天后用血糖仪测随机血糖，以不同两日随机血糖≥16.7 mmol/L 的大鼠为成模大鼠[10]，造模成功后继续给予大鼠高脂高糖饲料，并将成模大鼠随机分为模型组、大柴胡汤组、辛伐他汀组、二甲双胍组，每组10只。模型对照组、空白对照组给予生理盐水10 mL/kg/d 灌胃，大柴胡汤组给予大柴胡汤10.1 g/kg/d 灌胃，辛伐他汀组给予辛伐他汀20 mg/kg/d灌胃，二甲双胍组给予二甲双胍300 mg/kg/d灌胃，共8周。

1.2.2 标本收集

末次给药后，大鼠禁食12 h（不禁水），尾静脉血检测空腹血糖（FPG）。然后给予10%水合氯醛溶液（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉成功后腹主动脉取血，将血液标本分为两部分保存，一部分置于抗凝管（含肝素）中4℃保存，用于糖化血红蛋白（Hb A1c）检测，另一部分静置后分离血清置于EP管中-20℃存放，用于检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游离脂肪酸（FFA）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧族（ROS）的浓度。快速分离胰腺组织，一部分使用4%多聚甲醛固定并置于4℃冰箱中存放，用于胰腺组织HE 染色；另一部分置于冻存管内在-80℃冰箱保存，主要用于RT-qPCR 检测胰腺组织中PDX-1、MaFAmRNA的表达。

1.2.3 观察指标

1）一般情况观察；2）空腹血糖，生化检测HbA1C、TG、CH、FFA；3）测定ROS、MDA、SOD 的含量，计算抗氧化比值SOD/MDA；4）检测胰腺PDX-1、MafA mRNA表达；5）镜下观察胰腺病理形态的改变。

1.2.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，若试验数据呈正态分布，组间样本比较采用单因素方差（ANVOA）分析，两两比较采用LSD 检验。检验水准α= 0.05；若试验数据呈偏正态分布，数据分析结果使用四分位数和中位数的间距表示。

2 结果

2.1 大鼠一般状态比较

空白对照组大鼠一般精神状况良好，动作、反应灵敏，毛色白有光泽，进食、饮水量及尿量均正常，体重逐渐増加；模型对照组逐渐出现精神状态差、反应迟钝，皮毛污秽发黄且无光泽，明显多饮、多食、多尿，体重増长缓慢。大柴胡汤组和辛伐他汀组、二甲双胍组大鼠状态介于两组之间。治疗后，大柴胡汤组和辛伐他汀、二甲双胍组大鼠状态均较模型对照组改善，体重增长较空白对照组缓慢，但较模型组明显。

2.2 各组大鼠FBG、TG、TC、HbA1c、FFA比较

表1 示，与正常组对照相比，模型组FBG、HbA1c、TC、TG、FFA 显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组、大柴胡汤组、二甲双胍组FBG、HbA1c、TC、TG、FFA 显著降低（P＜0.01）；与辛伐他汀组相比，大柴胡汤组TG 降低（P＜0.05），FBG、HbA1c、TC、FFA 显著降低（P＜0.01）；与二甲双胍组相比，大柴胡汤组FFA 显著降低（P＜0.01），FBG、HbA1c、TC、TG 差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠ROS、SOD、MDA比较

表2 示，与正常组对照相比，模型组ROS、SOD、MDA 显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，辛伐他汀组、大柴胡汤组、二甲双胍组ROS、SOD、MDA 显著降低（P＜0.01）；与辛伐他汀组、二甲双胍组相比，大柴胡汤组ROS、SOD、MDA差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 胰腺PDX-1、MafA mRNA表达比较

表3示，与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠胰腺组织PDX-1、MaFA mRNA 表达显著下降（P＜0.01）；与模型组大鼠相比，辛伐他汀组、大柴胡汤组、二甲双胍组大鼠胰腺组织PDX-1mRNA 表达显著升高（P＜0.01），二甲双胍组大鼠胰腺组织MaFA mRNA 表达升高（P＜0.05），辛伐他汀组、大柴胡汤组大鼠胰腺组织MaFA mRNA 表达显著升高（P＜0.01）；与辛伐他汀组相比，大柴胡汤组PDX-1、MaFA mRNA 表达显著下降（P＜0.01）；与二甲双胍组相比，大柴胡汤组PDX-1、MaFA mRNA差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 镜下观察胰腺病理形态的改变

正常对照组大鼠胰腺中有大量正常的胰岛分布，组织结构清晰，细胞排列整齐，腺泡小叶完整；模型组与正常组相比较仅见少量残存的胰岛，结构紊乱，腺泡小叶轮廓破坏部分出血坏死，炎性细胞浸润明显；辛伐他汀组与模型组相比较，有散在新生胰岛分布，染色均匀，腺泡小叶结构较为完整，可见少量炎性细胞浸润；大柴胡汤组和二甲双胍组与模型组相比较，随着给药剂量的增加有散在新生胰岛分布明显，胰岛较模型组明显增加，偶见少量的炎性细胞浸润。

3 讨论

传统中医学对T2DM 的认识，认为T2DM 属于中医“消渴”的范畴。“消渴”的病机主要是阴津亏损，燥热偏盛，阴虚为本，燥热为标，临床表现以多饮多食多尿，身体消瘦为主，俗称“三多一少”。但“三多一少”往往是T2DM 发展到晚期才会出现的表现。随着人民健康意识的提高及医疗检测技术的进步，T2DM 的早期诊出率越来越高，患者被诊断为T2DM 时往往处于早中期，此时患者并不会有明显的“三多一少”的表现。临床治疗时若遵循以往中医学对T2DM 的认识，疗效就会大大降低。仝小林教授通过观察T2DM 的发病过程以及当今人们饮食习惯的改变，并结合内经中关于消渴的论述，提出T2DM 早中期类似内经所记载的脾瘅，其核心病机是中满内热。“脾瘅”是发展至“消渴”的重要阶段。中医认为脾主运化，脾将胃中的水谷化为精微物质并布散于全身各个脏器，糖是精微物质的一种，若脾失运化将会使糖类物质蓄积于血液中，无法布散到各个器官，引起血糖升高，然后进展为糖尿病。

表2 各组大鼠血清ROS、SOD、MDA比较（± s,n = 8）

表2 各组大鼠血清ROS、SOD、MDA比较（± s,n = 8）

注：ROS，活性氧；SOD，超氧化物歧化酶；MDA,丙二醛；与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与辛伐他汀组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与二甲双胍组比较，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01。

MDA/(ng·mL-1)0.45±0.42 1.44±0.17**0.43±0.04△△0.40±0.04△△0.47±0.15△△组别正常对照组模型组辛伐他汀组大柴胡汤组二甲双胍组ROS/(ng·mL-1)48.32±3.64 79.05±3.99**51.75±10.29△△42.95±15.77△△46.90±18.21△△SOD/(ng·mL-1)1.17±0.31 1.62±0.22**1.17±0.22△△1.06±0.67△△1.04±0.13△△

表3 各组大鼠胰腺组织中PDX-1、MaFA mRNA表达量比较（± s,n = 8）

表3 各组大鼠胰腺组织中PDX-1、MaFA mRNA表达量比较（± s,n = 8）

注：PDX-1，胰腺-十二指肠同源盒-1；MaFA，肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源A 基因；与正常对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与辛伐他汀组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与二甲双胍组比较，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01；

MaFA 1.000 0.113±0.033**0.800±0.105△△0.536±0.080△△▲▲☆☆0.293±0.062△组别正常对照组模型组辛伐他汀组大柴胡汤组二甲双胍组PDX-1 1.000 0.100±0.025**0.858±0.089△△0.572±0.103△△▲▲☆☆0.264±0.086△△

2 型糖尿病早期的病理基础是胰岛素抵抗，多伴有肥胖、血糖、血脂等异常[11]。仝小林教授认为2 型糖尿病早期类似于《内经》所记载的“脾瘅”[12]，并提出2型糖尿病早期的核心病机是中满内热或脾虚胃热，主要证型有肝胃郁热证、肠道湿热证、胃肠实热证。针对肝胃郁热型2 型糖尿病临床多选用“开郁清热”之法，大柴胡汤是其代表方。

大柴胡汤属于经典名方，出自张仲景所著《伤寒论》第103条，其临床应用非常广泛，可治疗多种疾病。大柴胡汤主治少阳阳明合病，症状多见往来寒热、胸胁苦满、呕不止、郁郁微烦、心下痞硬，其主要病机是肝胃郁热、日久痰浊血瘀[13]。大柴胡汤由柴胡、大黄、枳实、半夏、黄芩、芍药、大枣八味药组成，方中重用柴胡为君药，配以黄芩疏利肝胆，清热解郁，条达肝气，清解郁热；大黄、枳实泻热毒，破积滞，泻阳明热结，行气消痞；芍药柔肝缓急，配大黄通腑泄热；半夏和胃降逆；大枣配伍生姜调和脾胃。从大柴胡汤的药物组成可以看出大柴胡汤具有开肝郁、清胃热之功。

T2DM 多因过食肥甘厚味，精神过度紧张而致病。长期过食肥甘导致脾运呆滞，食物不得及时腐熟、运化，胃气阻滞则腑气不畅，水道壅塞；脾气不运则湿浊内停，日久化热，入血则浊。《灵枢·五变篇》云：“五脏皆柔弱者，善病消瘅”，“夫柔弱者，必有刚强，刚强多怒，柔者易伤也……怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留，皮充肌，血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅”揭示了肝与消瘅的关系。T2DM 初始多六郁相兼为病，中焦气机之升降，与肝的疏泄密切相关，长期过食肥甘脾运呆滞，土壅木郁，脾土反侮肝木，再加之精神因素的影响，肝疏泄功能失常，气郁血滞，郁而化热，发为消瘅。顾此类T2DM 的治疗应重在舒肝解郁、清肝泻肝，同时宜加用活血化瘀的药物。大柴胡汤全方苦寒而不伤胃，辛温而不生燥、祛瘀而不伤正，丝丝入扣，相得益彰，标本同治，恰切T2DM 早期“中满内热，肝郁气滞”的病机[14]。

氧化应激是指机体受到刺激后体内氧化作用与抗氧化作用失去平衡，也就是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）和活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS）生成太多而抗氧化系统无法将其完全清除[15]，产生了大量的氧化中间产物进而导致机体的损伤。生理条件下，自由基不断生成，又不断被清除，维持着动态平衡。机体受到缺氧、缺血、高血糖、高血脂等因素刺激后，ROS 产生过多，抗氧化系统清除氧化物的能力下降，机体常规的动态平衡被打破。未能及时清除的ROS和RNS 导致蛋白质、脂质、核酸等生物大分子损伤，进而引发机体组织和细胞损伤，导致多种疾病的发生。

机体内抗氧化酶系统主要有两类，以超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）为主的抗氧化酶系统和以维生素C 为主的非酶抗氧化系统，机体通过这两大系统使自由基体系的产生与清除保持动态平衡状态。SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）是机体内最主要的清除自由基的抗氧化酶，对维持机体氧化与抗氧化系统平衡起到了非常重要的作用。SOD 是一种天然的抗氧化酶，可以清除细胞内活性氧物质，对细胞维持氧化与抗氧化起重要作用，通过检测细胞内SOD 变化可以反映细胞遭受氧化应激的水平[16]。机体在病理状态下可导致机体内ROS大量生成，当机体内的抗氧化酶SOD、GSH-Px 等活性降低，自由基清除速率减慢时，会导致机体内自由基水平升高引起机体氧化应激状态。机体内的自由基多数是不稳定的，具有很强的反应活性，可以启动高效链锁反应生成脂质过氧化物、新的自由基、分解产物和衍生物，所以直接检测自由基是非常困难的，多以检测其产物如脂质过氧化物含量来间接测定机体氧化应激水平。反映机体氧化应激水平常用的指标是脂质过氧化程度，目前用于检测的主要产物为丙二醛（malondialdehyde，MDA），MDA 是脂质过氧化终产物之一，能间接反映机体氧化应激状态[17]。

氧化应激主要从两方面促进糖尿病的发生发展:①诱导β细胞功能受损，②诱发外周组织胰岛素抵抗。而外周组织胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷和/或数量不足是糖尿病发生发展的重要病理机制[18]。70% ～80%的2 型糖尿病患者伴有胰岛素抵抗（IR），IR[19]是指胰岛素的反应性下降，正常剂量的胰岛素产生低于正常的生物学效应，表现为胰岛素抑制肝释放葡萄糖的能力和促进周围组织利用葡萄糖的能力不足。机体为了将血糖恢复到正常水平，将会代偿性分泌更多胰岛素来降低血糖值，从而产生一系列病理变化。胰岛素抵抗在T2DM 的发病及病程进展中有着至关重要的作用，胰岛素在体内的作用受到氧化应激的影响，氧化应激可加重外周组织胰岛素抵抗。外周胰岛素抵抗导致机体对血糖血脂的利用减少，体内利用不了的糖类和游离脂肪酸发生自身氧化产生大量自由基，诱导氧化应激[20]。

氧化应激反应亦能影响胰岛β细胞的合成和胰岛素的分泌。胰腺启动因子1（Pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1）是胰腺特异性表达转录因子，也是一个核心因子，可进行多基因调控，其主要作用是促进P 细胞的分化和胰岛素的分泌，调控胰岛素的基因转录、修饰和排出维持胰岛β细胞的正常功能[21]。氧化应激会影响PDX-1的表达，可减少PDX-1 mRNA的合成[22]。实验证明对2 型糖尿病模型db/db 小鼠进行抗氧化治疗后，胰岛细胞核内的PDX-1 mRNA 的表达明显增多了[23]。氧化应激还能导致PDX-1 与胰岛素基因启动子的结合减少，影响PDX-1 的核质易位，而PDX-1 核质易位是促进胰岛素分泌的重要过程。所以氧化应激状态下，PDX-1 表达减少，胰岛素的合成和分泌也会减少。

MafA 是一种胰岛β细胞中特异性表达的蛋白，是调节胰岛素基因表达和调控胰岛β细胞成熟的重要转录因子，对胰岛素基因转录、胰岛素分泌和胰岛β细胞团的增殖、分化起着至关重要的作用[24]。有研究表明，MafA 与其他转录因子PDX-1、NeuroD 或Ngn3 协同作用可促进非胰岛β细胞转化为分泌胰岛素的细胞。而且PDX-1 的表达也受到胰岛β细胞中的MafA 基因的调控；T2DM 患者胰腺β细胞中MafA的含量显著减少，间接证明了MafA 的减少与人类T2DM 患者的β细胞功能受损相关[25]。

氧化应激反应参与多种疾病的发生、发展，与糖尿病的关系也非常密切[26]。

本次实验结果中与正常组对照相比，模型组ROS、SOD、MDA 显著升高，这表明糖尿病模型组大鼠抗氧化能力下降，体内自由基生成增加，清除率降低，细胞内ROS 生成增多，氧化应激反应增强。药物治疗8 周后，与模型组相比，大柴胡汤组ROS、SOD、MDA 显著降低；结果提示大柴胡汤可增强糖尿病大鼠抗氧化酶活性，增强清除氧自由基的能力。

与正常对照组大鼠相比，模型组大鼠胰腺组织PDX-1、MaFA mRNA 表达显著下降，表明模型组大鼠β细胞及其功能受损，药物干预8 周后，与模型组大鼠相比，大柴胡汤组大鼠胰腺组织PDX-1mRNA、MaFA mRNA表达升高，同样提示大柴胡汤能保护胰岛细胞，抑制胰岛细胞损坏进程。

本研究成功建立了2 型糖尿病实验动物模型，证实了高糖高脂饲料喂养加腹腔小剂量注射STZ 诱导2型糖尿病实验动物模型的可靠性。进一步证实了大柴胡汤可以调节2型糖尿病大鼠糖脂代谢，改善IR，提高外周组织对胰岛素的敏感性，保护胰岛β细胞。大柴胡汤在调节糖脂代谢的基础上，又能增强抗氧化物酶的活性，减少脂质过氧化副产物，减少糖尿病大鼠氧自由基的产生，增强糖尿病大鼠抗氧化能力。本实验探讨了大柴胡汤治疗2 型糖尿病的部分机制，但也不能排除其他多种途径的综合作用对胰腺细胞的影响，并且大柴胡汤的成分复杂，有关大柴胡汤对胰岛细胞的保护机理仍需进行后续实验进行验证，其抗糖尿病的作用机制还有待于我们的进一步全面而深入的研究，以期能为大柴胡汤防治T2DM 提供更多的实验依据。