丹皮酚对大鼠心肌梗死后心脏功能的改善及其对Pink1/Parkin的影响＊

刘 超，王明娟，范彦芳，单伟超＊＊

（1. 承德医学院附属医院 承德 067000；2. 承德医学院 承德 067000）

0 前言

随着人们生活水平的不断提高，生活节奏的加快，我国心血管疾病患者越来越多，中国已经成为心血管疾病负担最重的国家之一[1]。其中，冠状动脉粥样硬化型心脏病的发病率、死亡率日趋上升，严重威胁人类的健康和生活质量，不仅患病人数在中国飞速增长，冠心病也已成为全球第一位的死亡原因[1]。急性心肌梗塞（acute myocardial infarction，AMI）往往是冠心病的首发表现[2]，在过去的十几年中，心梗的预后已经得到了极大的改善，但其治疗方法还很有限，疗效也还不够理想[3-4]。常用的治疗手段（如再灌注治疗）虽然减少了心肌梗死面积[5]，但也使得更多人进入心梗后心室重构阶段，增加了心脏衰竭发生的风险[6]。因此，探究如何改善或逆转患者的心室重塑情况，对进一步提高心梗患者的预后具有积极意义。

在心梗发生时，心肌细胞氧和营养供应的短缺常导致线粒体功能障碍，此时，有效的线粒体自噬缓冲了线粒体功能紊乱带来的心脏毒性作用[7]，因此，通过使用靶向作用于线粒体的药物，可以达到显著减少住院率，改善心室功能的作用[8]。丹皮酚（paeonol）是分离自中药牡丹、芍药的干燥根皮的具有广泛生物活性的物质。丹皮酚曾被发现可以通过调控miR-1-PI3K-AKT轴提高心脏功能，减轻炎症，并增强心肌细胞自噬[9]，这提示丹皮酚对心梗后心室重构和心脏功能可能具有一定的改善作用，但其具体机制尚未完全阐明。

中医是中国医疗体系的重要组成部分，在西方医疗市场不断扩大的同时，中医市场也在不断扩大，尤其在心脑血管疾病方面对于中医的需求极大[10]。在心梗治疗方面，中医也具有广泛的应用，但由于其缺少临床数据支撑，配方复杂，机制难以阐明，阻碍了中医的进一步发展和国际化[10-11]。因此，有必要对中医配方中活性成分的功能及其机制开展探究。本研究通过建立心肌梗死的细胞模型和动物模型，首次观察丹皮酚对结扎冠状动脉前降支（LAD）诱导的MI 大鼠的治疗作用，并从线粒体自噬及Pink1/Parkin 角度探讨其可能的作用机制，为将丹皮酚开发成防治心血管疾病的新药提供有价值的药理实验依据，并为进一步改善心梗治疗手段和阐明中药作用机制提供理论基础。本研究是河北省卫生计生委医学科学研究重点课题项目（20181153）的一部分，并由其提供经费支持。

1 方法

1.1 细胞培养和转染

人心肌细胞H9C2 购买于American Type Culture Collection（ATCC，Manassas，Virginia），将细胞培养于含有10%胎牛血清并添加了1%青霉素、1%链霉素的RPMI-1640 培养基中（Gibco，Grand Island，NY，USA），于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。在细胞处于对数生长期时用于后续实验。

采 用Lipofectamin 2000 将siRNA-Pink1 转 染H9C2 细胞。细胞用0.25%胰酶消化后接种于6 孔板中，调整细胞密度为1 × 105个/孔。待细胞生长至80%-90%融合时，胰酶消化、收集细胞，随机分为空载体对照组（转染空载体）、转染组。继续培养96 h。

1.2 心肌细胞缺氧模型的建立

当H9C2 细胞生长至80%汇合度以上，弃去原培养液，更换为缺氧培养液（125 mM NaCl，8 mM KCl，1.2 mM KH2PO4，1.25 mM MgSO4，1.2 mM CaCl2，6.25 mM NaHCO3，5 mM s 乳酸钠，and 20 mM HEPES，pH 6.6），置于缺氧培养箱（GasPakTM EZ，BD Biosciences，Shanghai，China）中，根据制造商的说明书，调整培养环境为10%CO2和1%O2，培养2 小时。所有细胞分为三组：①对照组：正常培养；②缺氧组：置于缺氧环境和缺氧培养液中培养；③丹皮酚组：置于缺氧环境和添加了100 μM的丹皮酚的缺氧培养液中培养。

1.3 动物模型

将SD 大鼠用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉，气管插管，小型动物呼吸机辅助呼吸，钝性分离第4 或第5 肋间肌进入第4 或第5 肋间肌进入胸腔，用眼睑撑开器支撑开肋间，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约3 mm 处结扎左冠状动脉前降支（假手术组只开胸剪破心包，在相应部位挂线不结扎），以心电图出现ST 段抬高1/2 以上、左室前壁颜色变苍白视为MI 模型成功，逐层缝合关胸，待自主呼吸恢复后，拔掉气管插管，术后24 h 将存活大鼠分为MI组、MI+丹皮酚（12 mg/kg）组和Pink1 敲低组（同时进行丹皮酚灌胃处理和尾静脉注射2.5 mg/kg si-Pink1），手术第二天开始灌胃给药，给药周期4 周。设置假手术组，开胸，挂线不结扎。本实验已经获得本院动物伦理委员会批准。

1.4 大鼠血流动力学和超声心动检测

经胸超声心动图采用高分辨率超声心动系统（Visual Sonics，Toronto，Canada），检测左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、室间隔厚度（IVSD）、左室后壁厚度（LVPWT）、左室缩短分数（FS）、左室射血分数（EF）。使用生物机能采集系统BL-420S（Techman，Chengdu，China）检测左室舒张末压（LVEDP）、左室收缩末压（LVDP）、左室内压最大上升和下降速率（±dp/dt）。

1.5 ELISA

收集大鼠血浆和试验后的细胞培养液，根据制造商的说明书，使用酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（Multisciences（lianke） biotech，co.，ltd，Hangzhou，China）检测乳酸脱氢酶（LDH）活性和肌酸激酶同工酶（CK-MB）活性。

1.6 Western blot

收集细胞，用预冷RIPA 裂解液（Beyotime Biotcchnology，Shanghai，China）冰 上 孵 育20 min，13000 r/min，4℃，离心20 min。离心后取上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，调整蛋白浓度，煮沸变性5 min。采用12% SDS-PAGE 电泳1.5～2 h，转至PVDF 膜（Millipore，Bedford，MA，USA）。采用3% BSA的TBST 溶液在室温封闭膜。加入稀释好的一抗（anti-Pink1 兔抗人多克隆抗体，1:1000，ab23707 或anti-Parkin 小鼠抗人单克隆抗体，1:1000，ab77924 或anti-Mfn2 兔抗人多克隆抗体，1:1000，ab50838或anti-Beclin1 兔抗人多克隆抗体，1:1000，ab62557 或anti-LC3A/B 兔抗人多克隆抗体，1:1000，ab128025 或antip62 抗体，小鼠抗人单克隆抗体，1:1000，ab56416），放4℃过夜。TBST 洗膜5 次，每次3min。加入稀释好的二抗（山羊抗兔IgG 1:2000，ab205718 或山羊抗小鼠IgG 1:2000，ab205719），室温轻摇40min，TBST 洗膜6次，每次3 min。ECL（Amersham Pharmacia Biotech，Little Chalfont，UK）显影、定影和扫描。用软件ImageJ分析各条带灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH 灰度值的比值作为蛋白相对表达量进行分析。所有抗体均购自Abcam（Shanghai，China）。

1.7 TUNEL

孔板中各组细胞干预如前所述，去培养基，PBS洗涤一次。用免疫染色固定液固定细胞30～60 min，PBS洗涤一次。加入免疫染色洗涤液，冰浴孵育2 min。在样品上加50 μL TUNEL检测液（Beyotime Biotechnology，Shanghai，China），37℃避光孵育60 min。PBS 洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，每份样品随机选取5个视野，计算细胞凋亡率：凋亡率=凋亡细胞／总细胞×100%。

1.8 统计分析方法

本研究的数据全部使用SPSS 17.0 统计分析软件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）进行处理分析，计量资料采用“平均数±标准差”（x±s）表示，两组间比较使用独立样本t检验，以P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹皮酚减轻了心肌细胞损伤

本研究通过缺氧处理人H9C2 细胞建立了心肌细胞梗死的细胞模型，并通过100 nM的丹皮酚对其进行了处理以观察丹皮酚的作用。通过ELISA，本研究发现心肌损伤标志物LDH、CK-MB 因丹皮酚的处理而显著减少（图1A，图1B）。另外，TUNEL 的结果提示，H9C2细胞凋亡也因丹皮酚的处理而减轻（图1C）。这些结果共同提示丹皮酚对心肌细胞具有保护作用。

2.2 丹皮酚通过Pink1/Parkin促进了心肌自噬

为了探究丹皮酚是否影响了心肌细胞自噬，本研究通过western blot 对相关蛋白进行了检测。结果发现，丹皮酚的处理显著促进了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（图2B），Pink1、Parkin、Beclin-1 和Mfn2 的表达均显著增高（图2C-F），而p62 表达水平则降低，这说明丹皮酚对心肌细胞自噬具有促进作用。通过进一步研究发现，线粒体自噬相关通路蛋白Pink1 和Parkin 的表达水平均显著增高（图2G），这提示丹皮酚可能通过影响Pink1/Parkin通路促进心肌细胞自噬。

2.3 敲低Pink1 减弱了丹皮酚促进心肌细胞自噬的作用

为了进一步探究丹皮酚的作用机制，本研究通过向H9C2 细胞中转染了si-Pink1 以敲低Pink1 的表达，再次观察丹皮酚对H9C2 细胞的影响。本研究先通过Western blot 对Pink1/Parkin 的表达水平进行了检测，确认其确实被敲低了（图3B，C）。此外，本研究观察到敲低Pink1 后自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的比值显著降低，Beclin-1 和Mfn2 的表达水平显著下降，而p62 蛋白表达量显著增加（图3D-G）。这说明丹皮酚导致的自噬被Pink1的敲低抑制了。

2.4 敲低Pink1减弱了丹皮酚对心肌细胞的保护作用

为了进一步检测Pink1 对丹皮酚作用的影响，本研究对敲低Pink1 后丹皮酚发挥的对心肌细胞的保护作用进行了检测。本研究观察到与Paeonol 组相比。Paeonol+si-Pink1 组中心肌损伤标志物LDH 和CK 的含量显著增高（图4A，B），细胞凋亡率同样也增高了（图4C）。本研究的结果说明敲低Pink1逆转了丹皮酚的作用，提示丹皮酚通过激活Pink1/Parkin 信号通路促进线粒体自噬发挥其保护心肌细胞的功能。

2.5 丹皮酚对大鼠心脏组织中线粒体自噬相关蛋白表达的影响

本研究通过结扎冠状动脉左前降支在SD 大鼠体内建立了心肌梗死的动物模型，并通过向大鼠体内注射si-Pink1 敲低了Pink1 的表达。本研究通过western blot对大鼠心脏组织中Pink1和Parkin的表达进行了检测，确认了si-Pink1 注射的效果（图5B，C）。本研究进一步观察到，丹皮酚提高了SD大鼠心脏组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平的比值，提高了Beclin-1和Mfn2的表达水平并显著降低了p62的表达，这些结果在Pink1敲低后均被逆转（图5D-G）。以上结果提示丹皮酚通过激活Pink1/Parkin通路促进了SD大鼠心梗后的细胞自噬。

2.6 丹皮酚对大鼠心脏功能的影响。

本研究进一步观察了丹皮酚对大鼠心脏功能和心室重构情况的影响。通过超声心动图，本研究发现与假手术组相比，心梗组SD 大鼠LVESD、LVEDD、IVSD 显著增高，LVPWT、FS 和EF 显著下降，丹皮酚逆转了这种影响（图6A-F）。此外，本研究还观察到心梗组大鼠LVEDP 显著增高，LVDP 和± dp/dt 显著降低，丹皮酚同样在这些指标中逆转了心梗的影响（图大鼠心脏功能，减轻了心室重塑情况。至此，本研究通过体内外的实验，发现并证实了丹皮酚至少在一定程度上通过激活Pink1/Parkin 通路，促进心肌细胞线粒体自噬，进而在心肌梗死的进程中发挥保护心肌细胞的作用。

图1 丹皮酚对缺氧环境中H9C2细胞的保护作用

图2 丹皮酚对自噬相关蛋白的影响

图3 敲低Pink1对自噬相关蛋白表达的影响

图4 敲低Pink1对丹皮酚保护心肌细胞的影响

图5 丹皮酚处理和敲低Pink1后对大鼠心脏组织中自噬相关蛋白的表达

3 讨论

心肌梗死是导致心衰的重要原因[6]。目前，关于丹皮酚减轻心肌梗死情况的报道尚且不多，其潜在机制也尚未阐明。本研究通过建立心肌梗死的细胞模型和大鼠模型，发现丹皮酚可以通过影响Pink1/Parkin信号通路，增强心梗过程中的线粒体自噬，从而减轻心肌损伤，改善心梗后心室重构情况，提高心脏功能。

在心肌梗死过程中，线粒体功能紊乱是导致心肌细胞损伤的主要机制之一，心肌发生缺血时，心肌细胞内的钙超载将导致线粒体内钙含量增加，这导致了线粒体肿胀及其膜的通透性改变，并增加了心肌细胞内的代谢压力，而线粒体通透性过渡孔的开启和线粒体外模的通透性增加将启动心肌细胞坏死和凋亡的进程[12]。因此，通过自噬更新线粒体对于维持线粒体功能和心脏功能十分重要。本研究的研究发现，无论在缺氧培养的H9C2 心肌细胞中或在心肌梗死大鼠的心脏组织中，丹皮酚均显著提高了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，Beclin-1、Mfn2 表达同时增高，p62 表达则显著减少，提示丹皮酚促进了心梗进程中的细胞自噬。进一步的研究则表明，丹皮酚减弱了心肌细胞的损伤和凋亡，改善了大鼠心脏功能，逆转了心梗导致的心室重构。而当抑制线粒体自噬中的重要蛋白Pink1 后，丹皮酚的效果同样被抑制了。本研究的结果说明丹皮酚通过促进线粒体自噬减轻了心梗过程中的心肌损伤和心室重构。曾有研究报道，丹皮酚和丹参素的联合作用激活了Nrf2 通路，减少了心肌细胞的氧化应激反应，抑制了细胞凋亡[13]；另一项关于无复流的研究表明，丹皮酚显著减少了心肌梗死面积，改善了心脏功能[14]。这些研究发现的丹皮酚保护心肌细胞、恢复心脏功能的作用和我们发现的结果相一致。另外，也有不少研究发现，促进心梗过程中线粒体自噬改善了心梗病情。如利拉鲁肽通过促进SIRT1 的表达，激活了Parkin通路，进而促进了线粒体自噬，抑制了心梗过程中的心肌纤维化、炎症反应和心肌细胞死亡[15]。PEDF通过促进心梗过程中FUNDC1 调控的心肌细胞中线粒体自噬显著减轻了心肌细胞损伤[16]。这与本研究发现的作用机制相类似。因此，本研究通过体内外的实验，发现丹皮酚具有保护心肌的作用，证明了丹皮酚具有潜在的应用于改善心梗后心室重塑的能力。

图6 丹皮酚对大鼠心脏功能及心室重构的影响

Pink1/Parkin 是调控线粒体自噬的重要通路。发生线粒体功能障碍时，Pink1 降解异常，聚集于线粒体膜上，激活Parkin 的E3 连接酶活性，启动自噬过程[17]。Mfn2 是识别Pink1/Parkin 通路中识别受损线粒体的重要蛋白，Mfn2募集Parkin于受损线粒体，Parkin则通过一种依赖于Pink1 的方式与Mfn2 结合[18-19]。本研究通过使用丹皮酚处理缺氧培养的H9C2 细胞，发现丹皮酚显著提高了Pink1 和Parkin 的表达。敲低Pink1 后丹皮酚的效果被部分抑制。这些结果共同证实，丹皮酚至少在一定程度上通过Pink1/Parkin 通路发挥其保护心肌的作用。类似的，有研究发现乙酰胆碱可以通过激活Pink1/Parkin 通路减轻H9C2 受到的缺氧/复氧损伤[20]，这与本研究的结果相类似。此外，丹皮酚还曾被报道可以促进了Nrf2 的核转位[21]，不仅Nrf2 的缺失可以加速心梗后心衰的进程，Nrf2 还可以和Pink1 发生相互作用[22]，并调控了线粒体自噬[23]。丹皮酚也有可能通过这些对心肌细胞自噬产生一定的影响，更深层次的作用机制尚未被发现。在心肌梗死的进程中，Pink1 还发挥了减少线粒体碎片化的作用，鉴于丹皮酚促进Pink1表达的功效[24]，丹皮酚可能也会有类似的效果，这将进一步恢复线粒体功能，对减轻心肌细胞损伤有积极意义，但这还需要进一步探究。

总而言之，本研究通过体内外的实验，阐释了丹皮酚通过上调Pink1/Parkin，促进H9C2 心肌细胞中的线粒体自噬，进而减轻了心肌细胞损伤，改善了心脏功能，逆转了心室重构。本研究的研究提示丹皮酚具有一定的应用于临床防治心梗后心室重构的能力，并为丹皮酚的临床应用进一步提供了理论基础。