冬小麦叶片花青素相对含量高光谱监测

王伟东，常庆瑞，王玉娜

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌 712100)

叶绿素、类胡萝卜素和花青素是植物体中的主要色素，广泛存在于高等植物的根、茎、叶、花和果实中，并会随着环境变化而呈现出不同颜色，它们的相对含量能够反映植物生理状态和物候状况[1]。花青素为植物叶片中的第三大色素，是一种水溶性黄酮类化合物[2]，在小麦、玉米等农作物的胚芽鞘、茎秆等部位也有积累[3]。花青素具有多种功能，如有较强的抗氧化性，不仅有助于叶片损伤修复[4]，而且可以用于药物，预防冠心病、血栓等慢性病治疗[5-6]；花青素也可以通过吸收光能而减少叶绿素对光的吸收，潜在地调节光合作用，从而起到光保护的作用[7]。因此，了解花青素的存在，检测花青素的含量对于农田管理和检测具有重要作用[8]。

传统测量花青素含量的方法主要有微波法[9]、高效液相色谱法[10]以及分光光度计法[11]等，但是这些方法在检测花青素含量时不但浪费人力物力，而且毁坏叶片，也不能迅速、即时地大面积监测，因此需要一种精确且高效的方法来预测花青素含量[12]。高光谱能够快速、准确、无破坏性地重复检测花青素，故而在农业生产应用和植物生理研究方面有着巨大的发展潜力[13]。

高光谱遥感反演预测植被理化指数的方法在过去几十年里取得重大进步，但大多集中在叶绿素和类胡萝卜素，对于花青素的研究甚少[14-15]。有学者研究发现，通过选择对花青素敏感的绿光波段和对叶绿素敏感的红光波段与近红外波段组合，构建不同的光谱指数，可以有效地对一种或多种植物叶片花青素含量进行反演，例如红绿指数、花青素含量指数、调整花青素含量指数、花青素反射指数以及调整花青素反射指数等[16-17]，但是当作物种类发生变化时，叶片中叶绿素和花青素的含量发生变化，高光谱敏感波段也随之改变，上述指数则不适用，需要进一步修正，寻找新的光谱指数。近年来，偏最小二乘法(PLS)作为一种新型的多元统计数据分析方法，被广泛用于植物色素高光谱预测中，该方法在使用时可以最大地利用光谱信息，以取得较好的预测效果。小麦作为当今世界重要的粮食作物，但关于小麦花青素的研究却很少。本研究以关中地区的冬小麦为对象，利用SVC HR-1024i便携式光谱仪获取光谱数据，用Dualex Scientific+便携式测定器获取花青素相对含量数据，基于光谱数据分析不同生育时期的冬小麦叶片光谱特征，以不同波段任意组合的RSI、DSI、NDSI光谱指数为自变量构建一元回归模型，利用PLS构建多元回归模型，最终确定冬小麦叶片花青素相对含量的最优预测模型，以期为冬小麦农田信息快速获取与生长状况监测提供科学依据和有效手段。

1 材料与方法

1.1 试验设计与样品采集

本研究于2016-2017年度冬小麦田间试验进行。研究区位于陕西省杨凌区西北农林科技大学教学试验农场(108°10′E，34°14′N)和咸阳市乾县梁山镇齐南村(108°07′E，34°38′N)，供试品种为小偃22。杨凌试验点共设20个小区，小区面积为27.5 m2(5 m×5.5 m)，试验设氮、磷两种养分处理，每种养分设5个施肥水平，每个水平设2个重复，其中施氮水平分别为0、45、90、135和180 kg N·hm-2，施磷水平分别为0、22.5、45、67.5和90 kg P2O5·hm-2。乾县试验点共设36个小区，小区面积为90 m2(9 m×10 m)，试验设氮、磷、钾三种养分处理，每种养分设6个施肥水平，每个处理设2个重复，其中施氮水平分别为0、30、60、90、120和150 kg N·hm-2，施磷水平分别为0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg P2O5·hm-2，施钾水平分别为0、22.5、45、67.5、90和112.5 kg K2O·hm-2；另设，5个大田试验，每个大田面积为150 m2(15 m×10 m)，设0、60、120、180和240 kg·hm-25个施氮水平，每个水平设2个重复。各处理的肥料均在冬小麦播前一次性施入，生育期不追肥，其他栽培管理措施同一般高产麦田。

样品采集于冬小麦拔节期、抽穗期、开花期和灌浆期进行。采样时，每小区选取2个样点，在样点附近采摘10株植株冠层相同叶位(沿主茎自上而下第一片)的叶片，共摘取10片，用保鲜袋密封，装入蓝冰保温箱，带回实验室进行光谱及花青素含量定量研究。

1.2 花青素相对含量测定

Dualex Scientific+(Force-A，Orsay，法国)是一种新型便携式植物叶片测定仪器，对植物叶片花青素进行无损精准测定[18]。测定时每个样点从10片叶片中选择新鲜叶片6片，从叶柄至叶尖分段测量6次，求平均值作为该叶片花青素含量，再将6片叶片值平均得该样点叶片花青素相对含量。

1.3 叶片高光谱图像获取与处理

采用SVC HR-1024i 型全波段地物光谱仪进行叶片高光谱反射率测量，测量波长范围350～ 2 500 nm，光谱测定使用仪器内置光源，为消除环境变化对仪器的影响，每隔0.5 h进行一次参考板校正。测定时，对测定过花青素的6片冬小麦叶片，使用叶片夹夹住叶片，从叶柄至叶尖分段测量3次，取平均值为该叶片的光谱反射率，取6条光谱平均值作为该样点的光谱反射率。利用SVC HR-1024i PC 仪器自带软件对光谱数据进行预处理，并重采样至1 nm。经研究花青素对叶片光谱的响应波段主要在可见光和紫外波段，因此本研究主要选择350～1 000 nm波段进行分析[19]。由于光谱仪采集的是离散的数据，故采用式(1)对原始光谱数据进行一阶导数计算。

(1)

式中，Ri为波长inm处的光谱反射率，R′是Ri的一阶导数，λi为第i个通道的波长。

1.4 光谱指数选择

本研究利用Matlab软件计算350～1 000 nm波段范围内任意两波段组合的3种光谱指数[20-23]，即差值指数(diffierence spectral index,DSI)、比值指数(ratio spectral index,RSI)和归一化指数(normalized diffierence spectral index,NDSI)，并计算3种光谱指数与冬小麦叶片花青素相对含量的相关系数(r)，再利用Matlab制作3种光谱指数的相关性等势图，根据r绝对值最大原则，选取波段组合的光谱指数进行花青素相对含量分析。

1.5 预测模型建立与优化

对每个生育时期采集的122个样本按花青素值进行排序，采用分层抽样的方法抽取92个作为建模样本集，剩余30个作为检验样本集。利用JMP Trial 14软件中的偏最小二乘(partial least squares，PLS)构建模型。模型精度验证和预测能力评判采用决定系数(r2)和均方根误差(RMSE)两个指标来评价各生育时期不同模型的拟合和预测能力。r2越接近1，RMSE越小，表示模型拟合能力和预测能力越好[24]。

2 结果与分析

2.1 冬小麦叶片花青素含量及其光谱特征

经统计分析，冬小麦灌浆期叶片花青素平均含量明显高于拔节期、抽穗期和开花期(表1)，其次是拔节期的花青素含量，其他两个时期的花青素含量相近。

表1 冬小麦叶片花青素描述性统计Table 1 Descriptive statistics of anthocyanins in winter wheat leaves

在可见光范围内，冬小麦叶片反射光谱在不同时期的变化趋势基本一致(图1左)。在550 nm波段附近形成反射峰，反射率峰值在0.16～0.2之间；在680～720 nm波段范围，花青素反射率急剧升高，各时期最终在720～1 000 nm波段范围形成一个反射率大于0.4的高反射平台。在一阶导数光谱中，红边波段得到显著增强，其一阶导数光谱是整个波段范围的最大值(图1右)。

图1 不同生育时期冬小麦叶片光谱反射率和一阶导数光谱

2.2 冬小麦叶片花青素含量的高光谱模型

2.2.1 基于敏感波段的冬小麦叶片花青素预测模型

经对冬小麦花青素相对含量与光谱反射率进行相关性分析，在可见光范围内，拔节期在400 nm波段左右二者呈显著负相关，在550 nm波段附近呈极显著正相关，其他波段的相关性较差；抽穗期、开花期和灌浆期在500～700 nm波段呈显著正相关，相关系数最高分别为0.558 0、0.860 1和0.544 6，在近红外光范围内开花期呈极显著负相关，其他时期相关性均较低(图2)。经对冬小麦叶片花青素含量与一阶导数光谱的相关性分析，各生育时期在480～550和680～700 nm波段范围均呈显著正相关，在550～670和700～760 nm波段附近均呈负相关，最高相关性出现在开花期的755 nm波段处，r达到-0.899 4。

其次，每篇开场白中都有一定的话题与己方立场相关。而且，辩手所提出的立场都是己方动议的总体原因。Yoni Cohen-Idov用一个话题说明了己方立场：政府在公共场合设立监控录像的行为，“超越了其维护法律尊严和保障社会秩序的权利”，所以，我们提议取消这项政策。

图2 冬小麦叶片花青素含量与原始光谱和一阶导数光谱的相关性

根据前人经验[21]，分别从原始光谱和一阶导数光谱中选择与花青素相关性最高的波段作为自变量，构建叶片花青素一元回归预测模型(表2)。通过比较发现，以拔节期、抽穗期和灌浆期原始光谱敏感波段构建的模型的拟合性均较低，其他模型决定系数r2均超过0.5。其中，开花期的一阶导数光谱在预测集和验证集中，r2均最大(分别为0.852 4和0.901 6)，RMSE均最小(分别为 0.006 4和0.005 1)，说明利用一阶导数光谱对该生育时期的叶片花青素预测效果较好。由于使用一阶导数光谱敏感波段拟合的模型较简单、方便和准确，因此在精度许可的情况下，该方法可作为一种监测花青素的快速方法。

表2 基于敏感波段的冬小麦叶片花青素含量预测模型Table 2 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on sensitive bands

2.2.2 基于光谱指数的冬小麦叶片花青素预测模型

利用Matlab软件计算350～1 000 nm波段范围内任意两波段组合的RSI、DSI、NDSI三种光谱指数，并计算3种光谱指数与冬小麦叶片花青素相对含量的相关系数(r)，同时采用Matlab制作3种光谱指数的相关等势图(以开花期为例)。从图3可以看出，开花期的3种光谱指数均有r大于0.8的区域，表明这些波段组合而成的光谱指数与花青素含量密切相关，并且相关性较强的波段区域较为一致，约位于500～720 nm波段范围，其中RSI的相关性最高，达到 0.934 5。其他生育时期与开花期趋势变化具有相似性，相关性较强区域基本在500～720 nm波段。拔节期、抽穗期和灌浆期相关性最强的指数分别为RSI、NDSI、RSI。

依据相关系数大小选择3种光谱指数作为自变量(表3)，分别建立花青素含量一元预测模型(表4)。从表4可以看出，拔节期、开花期和灌浆期决定系数最高的为RSI模型，抽穗期为NDSI模型；在所有模型中，开花期RSI模型的决定系数最高(0.867 9)，RMSE最小(0.006 0)，说明以开花期RSI构建的模型拟合性最好。

表3 对花青素敏感的光谱指数入选波段相关指数及公式Table 3 Selected bands, formulas and related indices for spectral indices sensitive to anthocyanins

表4 基于光谱指数的冬小麦叶片花青素含量预测模型Table 4 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on spectral index

2.2.3 基于PLS的冬小麦叶片花青素预测模型

用偏最小二乘法(PLS)[25]，选择相关性较高的RSI、DSI、NDSI 3种光谱指数为自变量，构建各生育时期冬小麦叶片花青素含量的多元预测模型(表5)。从表5可以看出，PLS模型相较于单指数模型，决定系数均变大，表明模型预测效果提升。其中，抽穗期模型的决定系数r2最高，为 0.880 4，RMSE为0.006 8；开花期r2为 0.875 9，RMSE为0.005 8。这说明两个生育时期的模型均具有较高的拟合性。

表5 基于PLS冬小麦叶片花青素含量预测模型Table 5 Estimation model of anthocyanin content in winter wheat leaves based on PLS

对冬小麦叶片花青素含量的多元预测模型进行检验(图4)表明，拔节、抽穗、开花和灌浆期的预测值与实测值之间高度相关，其中开花期的r2和RMSE分别最大和最小，分别为0.925 7和 0.004 8；抽穗期次之，r2为0.898 2，RMSE为 0.007 2，说明基于PLS建立的冬小麦叶片花青素含量预测模型中，开花期的模型最稳定、精度最高，是监测冬小麦叶片花青素含量的最优模型。

图4 基于PLS冬小麦叶片花青素含量预测模型精度检验

3 讨 论

本研究表明，在以原始光谱敏感波段为自变量构建的各生育时期预测模型中，仅开花期模型的r2达到0.7，预测效果较好，敏感波段为547 nm，说明绿光波段是花青素含量的敏感波段，这与前人的研究结果基本一致；以一阶导数光谱敏感波段为自变量构建的各生育时期模型中，仅灌浆期模型的r2为0.3，其他生育时期模型精度均超过0.5，敏感波段分别为644、639和755 nm，均位于红光范围内，可见红光对植物体生长发育有重要影响，可以利用这一特征对小麦健康状况进行诊断。利用各生育时期冬小麦叶片一阶导数光谱的敏感波段构建花青素的一元预测模型，不但简单方便，而且精度有很大提高，可以作为一种监测花青素含量的快速方法。

在各光谱指数模型中，灌浆期模型的预测效果相较于原始光谱模型精度有所提高，但效果仍然较差，这是由于在灌浆期时，冬小麦体内各色素转化为植物生长所需的营养物质，对光的吸收和利用减弱，导致反射光谱异常，进而影响模型的精度。在拔节期、抽穗期和开花期中，RSI和NDSI模型精度均高于DSI模型，有更好的预测效果，而在这3个生育时期的两种光谱指数的入选波段中，均有来自红光和近红外光范围的波段，这是因为植物体对红光具有强吸收作用，红光的变化直接影响植物体生长，因此研究红光和近红外光对冬小麦生长发育阶段的影响机制具有重要意义。

单一光谱指数往往只包含作物光谱的部分信息，用其构成的模型的精度和稳定性都难以得到保证，因此本研究构建的PLS模型中，将3种光谱指数作为自变量建立多元估算模型，进一步提高了花青素含量的预测精度，稳定性也得到增强，能够快速、无损检测冬小麦生长状况。

4 结 论

(1)各生育时期叶片光谱反射率变化趋势相似，在550 nm处形成反射峰，在400 nm和680 nm处形成吸收谷，在680～720 nm波段内反射率急剧升高，最终在720～1 000 nm波段形成高反射平台。

(2)各生育时期模型中，开花期模型精度较高，表现稳定，可作为预测冬小麦花青素的最佳生育时期；开花期PLS模型可作为预测冬小麦花青素的最优模型。