夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

张梦佳 董诚明 朱畇昊

摘 要： 为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能，该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物，采用逆转录 PCR 技术获得夏枯草中GGPPS基因的全長核苷酸序列，并进行生物信息学分析;采用 qPCR 法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明：PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp，编码363个氨基酸，理论分子量为38 815.68 D，等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明，PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后，GA3 处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大，且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。

关键词： 夏枯草， PvGGPPS， 基因克隆， 诱导表达， 表达分析

中图分类号： Q943  文献标识码： A

文章编号： 1000-3142（2020）06-0882-09

开放科学（资源服务）标识码（OSID） ：

Abstract： In order to explore the biological characteristics and functions of GGPPS gene in Prunella vulgaris， the specific primers were designed based on the sequencing of P. vulgaris transcriptome. The full-length nucleotide sequence of GGPPS gene was obtained in P. vulgaris by reverse transcription PCR technology， and the bioinformatics analysis was done. qPCR was used to analyze the expression of PvGGPPS gene in ear induced by different exogenous substances and in different organs in P. vulgaris. The results showed that the PvGGPPS gene had an open reading frame of 1 092 bp and encoded 363 amino acids， with a theoretical molecular weight of 38 815.68 D and an isoelectric point of 5.69. PvGGPPS protein had the characteristic domain of isopentenyl pyrophosphate synthase family. Phylogenetic tree showed that PvGGPPS protein was closely related to Salvia miltiorrhiza and Coleus forskohlii GGPPS protein. qPCR analysis showed that the expression of PvGGPPS gene in leaves was higher than that in ears and stems. The expression level of PvGGPPS gene was increased in the ear after GA3 treatment for 24 h， one of seven exogenous substances treated. The expression of PvGGPPS gene in different tissues of Prunella vulgaris was quite different and was induced by exogenous substances treatment. The results of this study lay a foundation for further study on the function and expression regulation of PvGGPPS gene in the synthesis pathway of terpenoids from P. vulgaris.

Key words： Prunella vulgaris， PvGGPPS， gene cloning， induced expression， expression analysis

夏枯草（Prunella vulgaris）为唇形科植物夏枯草的干燥成熟果穗，始载于《神农本草经》，具有清肝明目、消肿散结的功效（《中华人民共和国药典》，2015），广泛分布于全国各地。夏枯草中含有三萜类、黄酮类、有机酸类、香豆素类、甾体类等多种化学成分（汪晓河等，2019）。夏枯草中次生代谢成分齐墩果酸和熊果酸具有明显的消炎、抗肿瘤和抗HIV等药理作用（张金华等，2018），应用前景巨大。夏枯草作为药食两用之品，具有重要的药用价值和经济价值，尤其是作为凉茶原材料的需求量巨大，使得夏枯草市场需求量呈增加态势，夏枯草资源逐渐变得紧张。快速发展的高通量测序技术和生物信息学分析方法为基因的鉴定和功能分析提供了更多的途径，吸引着越来越多的研究者把目光投入到分子领域。然而，目前已有的夏枯草分子水平相关研究还不够全面和准确，夏枯草分子相关数据库也不够完善。

香叶基香叶基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS），是植物萜类物质合成的关键酶之一（唐美瓊等，2017;方洁，2017）。目前已经在拟南芥、丹参、地黄等多种植物中克隆到GGPPS基因（化文平，2008;Li et al.，2015;赵乐等，2017;张艺丹，2018）。GGPPS在植物生长发育过程中起着重要的作用，GGPPS通过催化三分子IPP和一分子DMAPP反应生成GGPP。GGPP不仅是二萜类物质的前体物，还是类胡萝卜素、叶绿素、生育酚、脱落酸、赤霉素等物质的共同前体物，是植物多条重要次生代谢通路的节点（韩立敏，2015;梁敏华等，2018）。本研究在前期获得的夏枯草转录组数据库的基础上，克隆得到夏枯草GGPPS基因，通过诱导表达的分析探讨GGPPS基因对夏枯草中萜类成分合成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

夏枯草样品采自河南省确山县夏枯草GAP种植基地，由河南中医药大学董诚明教授鉴定为夏枯草（Prunella vulgaris）。

总RNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），反转录试剂盒（Thermo公司），荧光定量试剂盒（QIAGEN），DNA Marker（TaKaRa公司），PCR产物回收试剂盒（上海生工），PCR仪（美国 Bio-Rad 公司C1000 Touch ThermalCycler），荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems公司 Step One Plus）。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 提取与cDNA第一条链的合成 利用康为试剂植物总RNA 提取试剂盒提取夏枯草不同组织的总RNA，1% 琼脂糖凝胶电泳确定RNA完整性。cDNA 的合成步骤按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit进行操作，反转录得到的cDNA置于-20 ℃ 备用。

1.2.2 cDNA全长克隆 根据夏枯草转录组数据库基因注释信息，选取表达丰度（FPKM）较高、E-value值较低且序列长度完整的GGPPS基因的核苷酸序列，利用Primer Premer 5.0软件设计GGPPS基因的特异性引物。

以夏枯草叶片cDNA 为模板进行扩增：cDNA 2.0 μL，2 × Es Taq mix 10 μL，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，dd H2O 6 μL至体积为20.0 μL。反应程序： 95 ℃预变性1 min;95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环;72 ℃延伸5 min（朱畇昊等，2016）。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将扩增的目的条带切胶回收纯化，并连接到pMD19-T载体上，蓝白斑筛选，菌落经PCR检测后的阳性克隆送往上海生工生物技术有限公司进行双向测序。夏枯草中GGPPS基因的特异性引物见表1。

1.2.3 生物信息学分析 运用多种在线工具对夏枯草中GGPPS基因及编码蛋白进行生物信息学分析。利用ORF finder在线软件分析开放阅读框;运用DNAMAN软件翻译目的基因氨基酸序列，比对同源蛋白的序列;利用ExPASy Proteomics Server Protparam在线软件分析目的蛋白的理化性质;在线软件SinalP4.1 Server用于预测信号肽;运用软件SMART分析目的蛋白功能域。在线软件NPSA server和Swiss-Model分别用于预测蛋白质的二级和三级结构;运用在线工具BaCeIlo和ChloroP预测细胞定位和叶绿体转运肽切割位点。运用MEGA 7软件对目的基因及同源基因的氨基酸序列构建进化树分析。

1.2.4 夏枯草GGPPS基因的表达特性分析 采集新鲜的夏枯草叶片、果穗和茎，用自来水清洗干净，滤纸吸干水分，置液氮中冷冻后，放-80 ℃超低温冰箱备用。在夏枯草生长旺盛的时期（6月份），对生长状态一致的夏枯草果穗进行处理，分别喷洒50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）、17.14 μmol·L-1吲哚乙酸（IAA）、100 μmol·L-1乙烯利（ETH）、100 μmol·L-1硝普钠（SNP）、1 mmol·L-1无水氯化钙、10 μmol·L-1水杨酸（SA）、2.88 μmol·L-1赤霉素（GA3）。以喷洒前（0 h）的果穗为对照，24 h后采集处理组样品。

对夏枯草果穗、茎、叶及喷施7种外源物质的果穗中GGPPS基因相对表达量进行实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR，qPCR） 检测，qPCR检测的反应体系：2× SYBR Green PCR Master Mix10 μL，QN Rox Reference Dye 0.1 μL，正反向引物均为0.4 μL，模板cDNA 2 μL，RNase-Free Water 7.1 μL至终体积为20 μL。反应程序：95 ℃预变性20 s后，进行40个循环（95 ℃，1 s;56 ℃，20 s;95 ℃，1 s），60 ℃，20 s;95 ℃，1 s。夏枯草actin基因作为内参，扩增完成后进行溶解曲线测定，2-ΔΔCt法分析GGPPS相对表达量。

2 结果与分析

2.1 夏枯草GGPPS基因的cDNA全长克隆

琼脂糖凝胶电泳检测夏枯草GGPPS基因约为1 100 bp，经克隆测序后序列使用ORF Finder预测开放阅读框，克隆所得序列含有1个1 092 bp的完整开放阅读框，命名为PvGGPPS，NCBI基因登陆号为MK993565。夏枯草GGPPS基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。

2.2 夏枯草GGPPS蛋白的生物信息学分析

2.2.1 夏枯草GGPPS蛋白的理化性质预测 PvGGPPS蛋白预测编码363个氨基酸，理论分子量为38 815.68 D，等电点为5.69，带负电的氨基酸残基（Asp + Glu）有 44个，带正电的氨基酸残基（Arg + Lys）有37个，推测其为酸性蛋白;根据其不稳定系数为39.06，推测其为稳定蛋白（表2）。

2.2.2 夏枯草GGPPS蛋白的亚细胞定位和功能域分析 通过亚细胞定位预测分析（表3），发现PvGGPPS蛋白定位在叶绿体中。利用SMART在线软件对PvGGPPS蛋白进行功能域预测，图2结果显示：PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域polyprenyl_synt，位于第101位到第357位。

2.2.3 夏枯草GGPPS蛋白的疏水性、跨膜区预测 对PvGGPPS蛋白进行疏水性预测，由图3的预测结果可以看出该蛋白疏水氨基的数量大于亲水氨基酸的数量，可推测其为疏水性蛋白。PvGGPPS蛋白跨膜区预测结果表明该蛋白有2个跨膜螺旋区，位置分别为从176位到195位;从250位到266位（图4）。

2.2.4 夏枯草GGPPS蛋白的二级和三级结构预测 利用在线软件对PvGGPPS蛋白进行二级结构预测。结果表明该蛋白是由54.27%的α-螺旋、14.05%的延伸链、5.51%的β-转角和26.17%的不规则卷曲组成混合型蛋白。利用Swiss-Model在线软件预测蛋白三级结构，得到的预测结果见图5。结果显示PvGGPPS蛋白与拟南芥中AtGGPPS11蛋白（5e8l.1）的相似度为75.25%。

2.2.5 夏枯草GGPPS蛋白系统进化树的构建和多序列比对 通过BLAST序列比对，从NCBI数据库中下载丹参（Salvia miltiorrhiza）、毛喉鞘蕊花（Plectranthus barbatus）、芝麻（Sesamum indicum）、米团花（Leucosceptrum canum）、野甘草（Scoparia dulcis）、锈毛旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）、紫花风铃（Handroanthus impetiginosus）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、皱叶菸草（Nicotiana tomentosiformis）、烟草（Nicotiana attenuata）、大肠杆菌（Escherichia coli）、曼地亚红豆杉（Taxusx media）、银杏（Ginkgo biloba）、玉米（Zea mays）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、铁皮石斛（Dendrobium officinale）、马尾松（Pinus massoniana）、水稻（Oryza sativa）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、江南卷柏（Selaginella moellendorffii）、湖生红球藻（Haematococcus lacustris）、钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis）的GGPPS蛋白的氨基酸序列与PvGGPPS蛋白的氨基酸序列通过MEGA 7软件采用邻近法（N-J法，bootstarp值设为1 000，其余为默认条件）构建系统进化树，并选取部分植物的氨基酸序列利用DNNMAN软件进行多序列比对分析。

通过构建系统进化树（图6），可以看出PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系，进化关系具有较高的保守性;与双子叶植物进化关系较近， 与菌类、藓类、藻类、裸子植物、单子叶植物的进化关系较远。多序列比对显示PvGGPPS与6个物种间蛋白质氨基酸序列一致性达87.03%，序列中存在异戊烯基焦磷酸合酶家族的两个富含天冬氨酸的特征性序列：DDxxxxD和DDxxD（王中等，2018），分别为位于第157到第164位的“DDLPCMD”和第296到第300位的“DDILD”，起到底物结合与碳链延伸的功能;且含有1个CxxxC基序（D为天冬氨酸残基，C为半胱氨酸，x 为任意氨基酸残基）（图7）。

2.3 夏枯草GGPPS基因表达分析

利用qPCR方法检测PvGGPPS基因在夏枯草果穗、叶和茎中的表达量，以果穗为参照。结果显示PvGGPPS基因在3个样本中均有不同程度的表达量;在叶中高表达，其次是茎，在果穗中的表达量最少。PvGGPPS基因在叶中的相对表达量是在果穗中的95.39倍。PvGGPPS基因表达趋势与转录组测序结果一致（图8）。

通过外源施加7种外源物质来评价这些信号物质对夏枯草PvGGPPS基因表达的影响。在7种外源物质处理24 h后，可以看到GA3处理下PvGGPPS基因的表达量显著上调;SNP、MeJA、IAA、乙烯利和CaCl2处理在24 h时对该基因表达量均表现为明显下调。

3 讨论与结论

在多种植物GGPPS基因的研究中发现该基因的表达模式在不同植物间有明显的组织差异性（孙君等，2016;薛生玲等，2018;Wang et al.，2019）。本研究结果显示PvGGPPS基因在夏枯草的果穗、茎、叶3个样本中均有不同程度的表达量，在叶中高表达，其次是茎，在果穗中的表达量最少。通过亚细胞定位预测分析，发现PvGGPPS蛋白预测定位在叶绿体中。我们推测PvGGPPS可能主要与夏枯草叶片中叶绿素、赤霉素等的合成有关。在赵乐等（2016）的研究中发现地黄中的RgGGPPS1基因定位在叶绿体中，在根中的表达量最高，可能参与地黄中叶绿素等次生代谢产物的合成。这与本文研究结果相一致。

GGPPS基因易受植物激素诱导表达为其明显的表达共性。丹参中的GGPPS基因可能受到水杨酸的诱导表达，却被茉莉酸甲酯抑制表达（Kai et al.，2010）。在钱丹等（2013）的研究中发现不同诱导子处理后海南粗榧叶片中GGPPS基因的表达量明显上调，其中以MeJA诱导的效果最好。在本次实验中发现GA3处理下PvGGPPS基因的表达量显著上调。多项研究表明外源激素对植物的生长及某些基因的表达有一定影响（常青山等，2017;潘君飞等，2018;李璐等，2019），其中赤霉素（ GA3 ） 是一种调节植物生长和发育的双萜植物激素（王灿，2018）。郑伟等（2019）的研究发现在太子参中三个GH3基因的表达均受外源GA3诱导，且GA3能够诱导太子参发育过程中内源 IAA 的积累。张晨等（2018）研究发现在太子参块根生长发育过程中GA3 可通过影响 JA 从而促进皂苷的积累。因此，我们推测GA3能诱导夏枯草萜类生物合成途径中部分关键酶基因的表达。本研究丰富了GGPPS基因的种类，为后期的基因功能研究奠定了基础。

本研究结果表明，夏枯草中的PvGGPPS基因主要在叶中高表达且受外源GA3的调控， 并首次对夏枯草中的GGPPS基因进行研究，丰富了GGPPS基因家族的种类。但是对于PvGGPPS基前面序列号为NCBI登录号。

因参与具体哪一类成分的调节及该基因对夏枯草中三萜类成分合成的影响目前尚不清楚，还有待进一步研究。

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（责任编辑 何永艳）