扶正通络解毒汤对急性心肌梗死大鼠心肌组织内游离钙离子浓度、MMP-9、MDA及SOD的影响∗

范才清 陈 姚 张 帆 蒲建璐

（四川大学华西医院，四川 成都 610000）

急性心肌梗死（AMI）是患者冠状动脉出现供血不足或中断供血情况，导致心肌组织持续性处于缺血缺氧状态进而引发心肌坏死性病变［1］。国内外研究表明，除心功能降低外，AMI患者在病理上还表现为心肌组织钙稳态失调、心室重构和氧自由基生成。上述病理表现涉及多项观察指标，如心肌游离钙、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）［2-3］。研究上述指标的变化趋势，对于揭示AMI发病机制、评估疗效、为AMI治疗提供新的方向具有积极意义。在中医理论中，AMI属于“卒心痛”范畴，心脉瘀阻、心气内虚是本病的病因病机［4］。中药方剂扶正通络解毒汤由黄芪、丹参、水蛭、黄连、当归等中药材组成，具有通络解毒、益气活血的功效［5］，可针对AMI病因病机对症治疗，取得显著疗效，但目前尚缺少中药治疗AMI与西医理论中心肌组织钙稳态失调、心室重构和氧自由基生成调节关系的动物实验和临床研究［6］。本研究通过动物实验的方式探讨了扶正通络解毒汤对AMI大鼠模型血清MMP-9、MDA、SOD活性及心肌组织内游离钙离子浓度的影响及相关作用机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取60只健康的无特定病原体（SPF）级SD大鼠，均为雄性，体质量200～300 g，周龄10～12周，实验前体检身体健康、活动正常、心脏功能和心电图谱正常，预计生存期大于6个月，由上海剑钝生物科技有限公司提供，合格证号为SCXK（沪）：2019-0013。AMI大鼠模型构建、饲养和后续动物实验均与上海剑钝生物科技有限公司合作完成。造模前笼养大鼠7 d适应环境，饲养温度（22±2）℃，湿度（60±10）%，饮用水为纯净水，饲料符合GB14924.3-2010标准，实验周期4～6周，严格按国家实验动物管理法规进行实验。

1.2 实验药物 扶正通络解毒汤（组成：黄芪、银耳各30 g，丹参、生地黄、栀子、白芍各15 g，麦冬12 g，柴胡、红花、川芎、当归、连翘、檀香、金银花各10 g，水蛭、黄连各6 g，甘草7 g。药材由成都中医药大学医技所大药房提供，将上述药材浸泡后用400 mL水煎煮沸，去渣取药汁，继续煎煮浓缩至原液质量浓度为2 g/mL）。盐酸地尔硫片（合心爽，天津田边制药有限公司，国药准字H12020126），0.9%氯化钠溶液（青岛日水生物，10801-1），克赛依诺肝素钠注射液（NOFI WIN⁃THROP INDUSTRIE，规格0.6 mL∶6 000 A×aIU，2支）。

1.3 试剂与仪器 PBS缓冲液（上海鼓臣生物技术有限公司）、戊巴比妥钠（上海信裕生物科技有限公司）、大鼠血清MMP-9酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（上海美轩生物科技有限公司，MEXN-R0581）、SOD ELISA试剂盒（上海创祥生物）、MDA ELISA试剂盒（上海笃玛生物科技有限公司）、组织钙离子浓度比色法定量检测试剂盒（杰美基因，GMS50097.2）；大鼠血清CK-MB ELISA检测试剂盒（潍坊祺翔生物科技有限公司，MB-6930）、大鼠cTnI ELISA检测试剂盒（江西江蓝纯生物试剂有限公司，JLC14924）。BLS-X2兽用彩超机（徐州贝尔斯电子科技有限公司），ST-960多功能酶标仪（科华），6/0可吸收缝线（博达），D-16C台式小型冷冻离心机（赛多利斯），BS124S电子分析天平（赛多利斯），LS-20ECG动物心电图记录分析仪（北京拜安吉科技有限公司），HX-101E小型动物呼吸机（成都秦盟科技有限公司），UV754N紫外分光光度仪（青岛路博）。

1.4 分组与造模 见表1。采用随机数字表法将60只SD大鼠分为造模组与假手术组，每组30只。造模组采用改良冠脉结扎手术法制作AMI大鼠模型，术前以2.5 mL/kg腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液麻醉，大鼠肌腱反射消失后实施手术，取仰卧位，注射肝素钠，鼠颈前区除毛、备皮，分离右颈部外静脉和气管，连接呼吸机，潮气量6 mL/kg，吸气∶呼气比为1∶2，呼吸频率80次/min，胸前取备皮，连接心电监护装置（心电图），沿着锁骨中线做纵切口，剥离皮肤，L4～L5肋间钝性分离肌层，开胸，剪开心包，轻压胸廓，暴露心脏，在肺动脉圆锥、左心耳间，距冠状动脉起始2～3 mm处用6/0缝线结扎左冠状动脉前降支，此时大鼠左室前壁变白、心跳减弱，将心脏还纳胸腔，关胸、缝合切口，术后1～5 min内大鼠心电图Ⅱ导联ST段弓背向上抬高≥0.1 mV或病理性Q波作为手术成功的标志。假手术组仅开胸，不给予冠脉结扎，术后2 h抽取鼠尾静脉血测定CK-MB活性、cTnI浓度，造模组大鼠血清CK-MB活性比值及cTnI水平较假手术组升高，差异有统计学意义（P<0.05），证明造模成功。

表1 两组大鼠术后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比较（±s）

表1 两组大鼠术后2 h血清CK-MB比值及cTnI水平比较（±s）

与假手术组比较，△P<0.05

组别造模组假手术组cTnI（μg/L）1.97±0.46△0.92±0.21 n 30 30 CK-MB2/CK-MB1 1.86±0.42△1.25±0.17

1.5 干预方法 采用随机数表法将造模成功的30只AMI大鼠分为3组，各组10只，参照60 kg标准成人临床用药剂量，利用体表面积-剂量对应关系换算灌胃药液剂量1 mL/100 g。中药组予扶正通络解毒汤：用0.9%氯化钠溶液将扶正通络解毒汤2 g/mL稀释为1.4 g/mL，灌胃剂量为8 g/kg。西药组予盐酸地尔硫片溶液：将30 mg盐酸地尔硫卓片研成粉末后，加0.9%氯化钠溶液稀释为0.75 g/L，灌胃剂量2.6 mg/kg。模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃。各组均在成模24 h后通过灌胃给药，每天给药1次，连续给药7 d，期间检测和比较3组大鼠相关指标水平。

1.6 标本采集与检测 1）血清MDA、MMP-9浓度和SOD活性：在给药前后抽取鼠尾静脉血约1 mL置于不含热原和内毒素的试管中，3 000 r/min离心10 min取上清液在2 h内完成检测，不能在2 h内完成检测的血清样本及试剂盒均应保存在4℃环境中。检测时利用96孔板上样，每组待测血清样本做3个复孔，按照ELI⁃SA检测试剂盒说明书要求操作，主要步骤为：预处理→上样（标准品、待测品稀释液，平行样本）→加带有辣根过氧化物酶（HRP）标记的一抗→封孔，37℃孵育60 min→洗板（PBS缓冲液洗涤5次）→加二抗，封板，37℃避光孵育15 min→加显色液、终止液→利用酶标仪测定各孔OD值。检测方法为双抗夹心法，利用酶标仪测定血清MDA、MMP-9和SOD吸光度，检测波长450 nm，并利用标准曲线换算成浓度值和单位酶活值。2）比色法测定梗死区心肌游离钙离子浓度：给药第7日，在抽血完成后处死各组大鼠，通过手术取出大鼠心脏组织，在显微镜引导下将梗死区心肌剪成小块，称质量后用PBS溶液清洗，利用液氮冷冻并碾成粉末，加入裂解液后孵育30 min制成心肌细胞液，16 000 r/min离心5 min，取上清，按照检测试剂盒说明书要求，利用比色法测定心肌游离钙离子浓度，分光光度仪的检测波长为570 nm。

1.7 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。对研究资料之间进行对比分析，计量资料表示为（）形式，组间两两配对比较采用t检验；计数资料（%）组间两两比较采取χ2检验；组内资料两两比较采取单因素方差分析，3组及以上资料比较则采取Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清MMP-9、MDA和SOD水平比较见表2。给药7 d后，与给药前相比，3组AMI大鼠的血清MMP-9、MDA浓度和SOD活性改善水平差异有统计学意义（P<0.05）。MMP-9、MDA浓度：中药组<西药组<模型组；SOD活性：中药组>西药组>模型组。

表2 各组大鼠干预前后血清MMP-9、MDA浓度及SOD活性比较（±s）

表2 各组大鼠干预前后血清MMP-9、MDA浓度及SOD活性比较（±s）

与本组干预前比较，∗P<0.05；与中药组同时期比较，△P<0.05；与西药组同时期比较，▲P<0.05

组别中药组（n=10）西药组（n=10）模型组（n=10）时间干预前干预后干预前干预后干预前干预后MMP-9（nmol/L）465.42±48.17 276.54±24.82*464.98±49.06 382.45±30.95*△465.89±50.47 459.46±48.74*▲MDA（nmol/mg）3.05±0.41 1.24±0.21*3.02±0.35 2.05±0.19*△3.04±0.43 2.97±0.41*▲SOD（nU/mg）5.12±0.95 20.72±2.14*5.14±1.03 13.25±2.95*△5.09±0.91 5.02±1.05*▲

2.2 各组大鼠梗死区心肌组织内游离钙离子浓度比较 见表3。给药第7日，3组大鼠梗死区心肌组织内游离钙离子浓度比较，差异有统计学意义（P<0.05）：中药组<西药组<模型组。

表3 各组大鼠梗死区心肌组织内游离钙离子浓度比较（nmol/L，±s）

表3 各组大鼠梗死区心肌组织内游离钙离子浓度比较（nmol/L，±s）

与中药组比较，∗P<0.05；与西药组比较，#P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

组别中药组西药组模型组n 10 10 10梗死区心肌组织内游离钙离子浓度159.62±9.74#△208.18±8.43*△321.82±15.19*#

3 讨论

AMI是一种发病率、致死率和致残率较高的心脑血管疾病。AMI病因的十分复杂，一般认为，冠动脉供血供氧不足是诱发AMI的主因［7］，而国内外近年来的研究则指出，AMI的发生和进展还很有可能与下述原因有关。1）心肌细胞游离Ca2+负责调节心肌舒缩功能，其浓度水平也与心肌细胞兴奋程度呈正相关，而AMI发生后患者心肌游离Ca2+出现超载，患者心脏收缩和舒张出现障碍，引发心力衰竭［8-9］。2）心肌组织持续性缺血缺氧会引发心室重构，心肌组织通过分泌MMPs来降解心肌胶原蛋白和基底膜，重塑心脏适应性。而研究也提示，此时患者血清中MMP-9的浓度较正常水平显著升高［10-11］。（3）AMI发生后，患者大脑中氧自由基的产生明显加快，此时SOD会因清除过多氧自由基而消耗，并产生大量生物毒性脂质过氧化物MDA，从而损伤患者脑细胞和神经细胞，引发脑梗死等不良反应［12］。西医针对AMI成因和进展趋势，采用钙离子阻滞剂如硫氮酮等药物治疗，以抑制心肌钙离子内流、扩张冠状动脉血管、松弛心血管平滑肌［13］，临床研究结果显示，应用硫氮酮治疗AMI的有效率为60%～70%，对于室上性心动过速的疗效优秀，高达88%～94%，对于心血管血氧供应改善十分显著［14］。不过硫氮酮对于抗氧化指标和心室重构的影响少有文献提及，也具有较多的不良反应和禁忌证，因此应探寻一种更为安全有效的AMI治疗方案，以便获得更理想的疗效和预后［15］。

近年来，临床越来越重视将中医辨证论治或中西医结合治疗心血管疾病。中医理论将AMI归为“胸痹”“卒心痛”范畴，认为AMI的病机分为禀赋不足、瘀血阻心、痰瘀闭心、情志致郁、寒邪凝滞等。AMI患者的共同病证为心络不通，虽原因各异，但均应活血散结、解毒通络。中医认为浊毒是炎症因子、氧自由基，而钙调紊乱、心室结构改变则是“阻络”表现［16］。扶正解毒通络汤方中含有丹参、黄芪、黄连、栀子、麦冬、水蛭等中药材，从组方配伍上分析，丹参归心、肝经，可活血祛瘀，通经止痛；黄芪可补益正气；丹参、黄芪二者为君药，主治胸痹心痛。水蛭可破血通经、黄连可清热解毒，水蛭、黄连为臣药，主治心经实热。麦冬可润肺清心、泻热生津；柴胡可和解表里，疏肝解郁，升阳举陷；白芍可养血调经止痛，麦冬、白芍和柴胡均为佐药，主治热病心烦、胸胁胀痛。连翘、甘草为使，可清热、解毒、散结、消肿、调和诸药，主治心气虚，心悸怔忡。基于动物实验的现代药理学也表明，扶正通络解毒汤中的丹参酮ⅡA可显著缩小心肌梗死范围，复方丹参注射液则具有抗心肌缺血、减少心肌细胞膜的脂质过氧化反应、抑制Ca2+内流的功效；黄芪则富含多糖、皂苷类、黄酮类和氨基酸化学物质，黄芪总皂苷具有抗氧化、清除氧自由基等药理作用，黄芪甲苷则具有舒张血管平滑肌、缓解肌浆网、保护脑细胞等药理作用，可有效预防心室重构、保护心肌组织；其余中药材则具有免疫调节、降血糖、降血压、抗疲劳、抗炎等药理作用［17］，这些都是扶正解毒通络汤治疗AMI的理论基础。

至今为止，虽有文献对心肌细胞游离Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指标水平与AMI疗效和预后的关系进行了研究，证实上述实验室指标检测结果与AMI患者的疗效评估、转归预后具有关联性，但仍缺少将中药疗效与心肌细胞游离Ca2+、MMP-2、MMP-9和心肌抗氧化指标联系起来的研究［18］。本研究结果显示，给药后3组AMI模型大鼠的血清MMP-9、MDA浓度、SOD活性及梗死区心肌组织内游离钙离子浓度比较差异有统计学意义（P<0.05）。结果表明扶正通络解毒汤可促进AMI模型大鼠的MMP-9、MDA浓度和SOD单位活性水平的改善，也能降低缺血心肌组织内游离钙离子浓度水平。这一结果值得进一步研究。