电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后TGF-β1、CTGF、Vimentin表达的影响∗

鲁 曼 徐 菁 李欣怡 陈 莉 陈 洁

张佳怡1 许 玥1 白玉琢1 张 莉1△ 刘 通2△

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.广东省第二中医院，广东 广州 510095）

腰痛是临床治疗中最常见的症状之一，多见于腰背部区域疼痛不适，可沿臀部放射至大腿部，严重者出现麻木、沉重、酸软、乏力等伴随症状。有研究发现［1］，慢性腰痛反复发生的原因可能有两点：腹部和腰背部核心肌肉群力量减小以及脊柱稳定性功能降低。多裂肌是人体重要的核心肌群之一，它位于脊柱两旁内侧，能够协助脊柱完成侧弯、旋转、前后屈伸等动作，由于其独特结构，在维持脊柱稳定性方面有关键作用［2］。针刺治疗腰痛在临床上已经得到普遍认可，是临床治疗腰痛常用的方法之一［3-6］。本课题组前期研究表明［7］，电针委中穴能够加速肌卫星细胞增殖的周期性进程，进而促进多裂肌的损伤修复，肌纤维再生和结缔组织生长因子的协调作用对肌肉修复具有重要的影响。本实验目的是观察电针委中穴对多裂肌修复过程中转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、波形纤维蛋白（Vimentin）的表达变化，进一步研究电针委中穴对骨骼肌修复过程中肌纤维再生以及纤维化因子的影响，并且找到针灸治疗的最佳疗程。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠，8周龄，54只，体质量（280±20）g，购于北京维通利华实验动物中心［许可证号：SCXK（京）2016-0006］，所有大鼠随机分笼饲养，进食和饮水不受限，适应性喂养7 d，明暗周期各12 h，环境温度24℃，湿度40%～50%。

1.2 试剂与仪器 主要试剂：布比卡因（美国Sigma公司）；10%水合氯醛（北京欧北生物）；16%多聚甲醛溶液（北京雷根生物）；Masson三色染色试剂盒（北京So⁃larbio公司）；TGF-β1抗体，CTGF抗体和Vimentin抗体（美国proteintech公司）；山羊抗兔IgG（北京鼎国昌盛）；抗体稀释液（北京鼎国昌盛）；DAB显色液（北京鼎国昌盛）。主要仪器：韩式电针仪（北京思盛达医疗器械中心）；半自动化石蜡切片机（北京弘泰嘉业）；电热恒温培养箱（黄石恒丰）；显微镜及成像软件系统（日本奥林巴斯株式会社）。

1.3 分组与造模 采用完全随机数字表法将54只大鼠分为空白组、模型组和电针委中组，每组18只，各组再随机分为3个时间点（治疗1、3、7 d），每个时间点6只。除空白组不做任何处理外，其余各组以10%水合氯醛溶液（350 mg/kg）腹腔注射进行麻醉，操作过程必须在无菌的环境下，然后剔除大鼠腰背部毛发，找到大鼠L4、L5水平棘突对应两侧的4个点进针，针头紧贴棘突旁进入肌肉，直到触及关节突和乳突所在的骨面后再回抽无血时，以每个点100 μL注入0.5%布比卡因溶液，且时间不得短于3 s，这样更加有利于药物的吸收。

1.4 干预方法 空白组不进行任何处理。电针委中组在造模后24 h进行治疗，将大鼠固定在实验室操作桌上，暴露出双侧后肢的腘窝部，找到委中穴（膝关节背面正中的位置），用一次性针灸针（华佗牌，0.30 mm×13 mm）直刺3 mm，再接上韩式电针仪，采用2～100 Hz的疏密波，电流1 mA，每日治疗1次，每次治疗20 min。模型组造模后不做治疗，只需与电针委中组同步进行固定。

1.5 标本采集与检测 各组大鼠分别在治疗1、3、7 d后进行取材，用10%水合氯醛溶液进行腹腔注射，大鼠完全处于麻醉状态下后，将其固定在鼠板上，充分暴露背部，剔除背毛，剪开皮肤，剥离开筋膜、肌肉，锐性切取L4～5水平的多裂肌，左侧迅速放于液氮中固定，随后-80℃进行保存，右侧置于4%多聚甲醛溶液中进行固定。1）Masson染色观察多裂肌形态学变化。右侧多裂肌在4%多聚甲醛溶液中固定好后，石蜡包埋，组织切片。将切片放在二甲苯中进行脱蜡处理，然后用梯度乙醇和蒸馏水水洗；Weigert铁苏木素染色5 min；酸性乙醇分化10 s；蓝化液返蓝3 min；蒸馏水洗1 min；丽春红品红染色5 min；弱酸工作液洗1 min；磷钼酸洗1 min；再用弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色2 min；弱酸工作液洗1 min；梯度乙醇脱水数次；二甲苯透明；中性树胶进行封片。最后借助显微镜在镜下观察各组多裂肌组织形态的变化。2）免疫组化法（IHC）检测TGF-β1、CTGF、Vimentin的表达。将切片放在65℃环境下烤片处理15 min，然后二甲苯脱蜡两次，15 min/次；梯度乙醇脱水（100%，90%，75%，50%）；高压锅热抗原修复处理；PBS冲洗；滴加双氧水室温下孵育15 min；滴加正常非免疫血清，37℃下孵育30 min封闭；滴加一抗后4℃孵育过夜（TGF-β1按照1∶200稀释，CTGF按照1∶200稀释，Vimentin按照1∶1 000稀释）；滴加山羊抗兔IgG（1∶25稀释），37℃下孵育40 min；滴加DAB显色工作液，然后在显微镜下观察，出现棕黄色后可随时终止反应；苏木素（1∶25稀释）复染10 min，；脱水透明，中性树胶进行封片。在显微镜下观察采集图像，然后用Image Professional Plus 6.0软件进行图像分析处理。

1.6 统计学处理 应用SAS8.2统计软件。计量资料以（）表示。数据服从正态分布，组间差异用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验处理。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的腰多裂肌组织形态学变化 见图1。空白1、3、7 d组可见到大量红染的肌纤维整齐排列；模型组可见散状、星点、不规则分布的红色肌纤维，而蓝色的胶原纤维则大量分布；针刺委中组与模型组相比，可以见到被红染的肌纤维，而蓝色的胶原纤维则相对减少。

图1 各组大鼠腰多裂肌组织形态结构（Masson染色，200倍）

2.2 各组大鼠腰多裂肌组织中TGF-β1表达水平比较 见表1，图2。治疗1、3、7 d时，同时间点模型组与电针委中组TGF-β1的表达均高于空白组（P<0.01），与模型组相比，同时间点电针委中组的表达有所减少（P<0.01）。

表1 各组大鼠腰多裂肌中TGF-β1表达水平比较（MOD值，±s）

表1 各组大鼠腰多裂肌中TGF-β1表达水平比较（MOD值，±s）

与空白组比较，∗P<0.05，∗∗P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下同

组别空白组模型组电针委中组n 6 6 6 1 d 0.038±0.016 0.091±0.016**0.067±0.009**△△3 d 0.056±0.008 0.101±0.007**0.076±0.006**△△7 d 0.050±0.007 0.094±0.007**0.075±0.011**△△

图2 各组大鼠不同时间点腰多裂肌TGF-β1表达（免疫组化染色，200倍）

2.3 各组大鼠腰多裂肌组织中CTGF表达水平比较见表2，图3。治疗1 d时，与空白组比较，模型组与电针委中组的CTGF表达有所上升（P<0.01或P<0.05）；与模型组比较，电针委中组的表达量减少（P<0.05）。治疗3 d时，模型组表达量高于空白组（P<0.01），电针委中组表达量也高于空白组，但差异无统计学意义（P>0.05），与模型组比较，电针委中组的表达量更低（P<0.05）。治疗7 d时，模型组与电针委中组表达量高于空白组（P<0.01），且电针委中组的表达量显著低于模型组（P<0.01）。

表2 各组大鼠腰多裂肌中CTGF表达水平比较（MOD值，±s）

表2 各组大鼠腰多裂肌中CTGF表达水平比较（MOD值，±s）

组别空白组模型组电针委中组n 6 6 6 1 d 0.057±0.016 0.105±0.017**0.080±0.012*△3 d 0.054±0.015 0.090±0.019**0.066±0.006△7 d 0.043±0.012 0.132±0.033**0.089±0.017**△△

图3 各组大鼠不同时间点腰多裂肌CTGF表达（免疫组化染色，200倍）

2.4 各组大鼠腰多裂肌组织中Vimentin表达水平比较 见表3，图4。治疗1 d时，模型组与电针委中组的Vimentin的表达量较空白组增加（P<0.01），与模型组比较，电针委中组的表达量较模型组增加（P<0.01）。治疗3 d时，与空白组比较，模型组与电针委中组表达量明显上升（P<0.01）；电针委中组的表达量比模型组更高（P<0.01）。治疗7 d时，模型组与电针委中组表达量显著高于空白组（P<0.01），与模型组比较，电针委中组的表达量有所上升（P<0.05）。

表3 各组大鼠腰多裂肌中Vimentin表达水平比较（MOD值，±s）

表3 各组大鼠腰多裂肌中Vimentin表达水平比较（MOD值，±s）

组别空白组模型组电针委中组n 6 6 6 1 d 0.052±0.016 0.082±0.007**0.119±0.016**△△3 d 0.037±0.012 0.077±0.007**0.118±0.007**△△7 d 0.044±0.012 0.084±0.008**0.104±0.017**△

图4 各组大鼠不同时间点腰多裂肌Vimentin表达（免疫组化染色，200倍）

3 讨 论

在全世界范围内，约有80%的人群患有慢性腰痛。腰痛症状轻重不一，严重者会影响工作、学习以及生活各个方面，其中大约25%的患者会选择就医［8］，以减轻不适感。有研究表明，腰痛患者中大部分存在多裂肌萎缩［9］以及脂肪浸润［10］，而且浸润程度与年龄增长呈正相关，这与多裂肌的分布位置和本身具有的独特结构，以及维持腰椎稳定性功能有关。有研究报道，布比卡因作为局麻药起效迅速，而且与给药部位有关，3种药物相比，布比卡因最容易引起肌肉的毒性，而且它导致的凋亡细胞数量最多［11］；在运动阻滞效应方面，它所起的效果明显高于另外两种药物［12］。本实验大鼠模型制备选择肌肉注射0.5%布比卡因溶液，是因为它的效应具有选择性，只会影响肌纤维而并不改变基底膜以及细胞的再生能力，而且0.5%布比卡因起到阻滞作用的同时，不具有任何血流动力学副作用［13］，不影响与骨骼肌修复再生能力相关的其他因素。实验证明损伤后24 h介入电针治疗是多裂肌修复的最佳时机［14］，因此本实验选择干预时机为造模后24 h，观察多裂肌修复过程中，不同治疗疗程组大鼠多裂肌肌纤维的表达变化。

TGF-β1可以通过激活卫星细胞，调节结缔组织再生，改变免疫反应强度这几个方面来参与骨骼肌的损伤修复［15］，而骨骼肌萎缩是TGF-β1调节的病理状态之一［16］，会出现肌肉力量减弱和肌肉质量下降的表现。有研究证明［17］，TGF-β1能够促进成纤维细胞进行增殖，进而诱发肌肉纤维化发展。谢慧等［18］研究发现电针干预可以抑制TGF-β1/Smad3信号通路，缓解腓肠肌萎缩的进程，加速肌卫星细胞的分化，促进骨骼肌纤维再生修复。仝乐［19］研究表明电针穴位之后，TGF-β1的表达降低，细胞外基质的沉淀会减少，肌纤维的再生与修复能力能够得到促进。实验结果显示，治疗1 d和3 d时，电针委中组TGF-β1的表达比模型组减少（P<0.01），说明了TGF-β1在损伤修复过程中被抑制，细胞外基质沉淀减少，进而促进肌肉修复。电针委中组治疗7 d时，和3 d时的表达维持在同一水平线上，几乎没有差异，这说明电针委中穴治疗能够在多裂肌损伤修复的早期发挥抑制肌肉纤维化因子的作用，进而促进肌卫星细胞的增殖与分化，减少损伤肌肉修复过程中的负效应。

CTGF是结缔组织生长因子，器官组织的纤维化发展与其有密切的关系。现有研究表明［20］，作为促组织纤维化蛋白，当机体组织处于损伤情况下时，CTGF会大量分泌，而且与皮肤瘢痕形成、血管粥样硬化、损伤修复障碍、器官组织纤维化发展具有一定的联系［21］。孙桂莲等［22］研究表明，CTGF的表达增强与进行性肌肉营养不良患儿的肌肉萎缩纤维化关系密切，在纤维化过程中发挥了重要作用。吴珍元等［23］研究表明不同强度电针刺激可以抑制靶器官的结缔组织再生，减轻失神经骨骼肌萎缩程度，从而防止纤维化。治疗1 d和3 d时，同时间点电针委中组与模型组相比CTGF的表达减少（P<0.05），治疗7 d时，电针委中组的表达低于模型组（P<0.01），同时电针委中7 d组比电针委中3 d组表达增加，这说明电针在抑制结缔组织生长因子的过程中，3 d组的抑制能力最强，随后减弱。

Vimentin作为一种细胞骨架蛋白，是肌肉损伤修复病理学研究领域的新发现［24］。有研究表明［25］，在肌肉再生的早期过程中，Vimentin能够促进肌卫星细胞的激活，在肌肉损伤修复方面发挥着重要的作用。治疗1 d和3 d时，与模型组相比，电针委中组Vimentin的表达增加（P<0.01），治疗7 d时，电针委中组与模型组之间也有明显差异（P<0.05），但7 d时电针委中组表达低于治疗3 d时。这说明在电针委中的干预过程中，治疗3 d时，损伤肌肉恢复的效果达到最佳。

“腰背委中求”，是历代医家经验的总结，从古至今，一直是针灸医生临床选穴治病的理论支持。足太阳膀胱经的经络循行路线经过脊柱两侧，并且到达腰部，其中一分支从臀部穿过到达腘窝处，即委中穴所在的位置；足太阳膀胱经与足少阴肾经相表里，二者分布于下肢外侧后缘和内侧后缘，且腰为肾之府；足太阳经筋起于足小趾，沿跟腱向上止于腘窝部，因此委中穴既是膀胱经的合穴、下合穴，也是足太阳经筋其中一分支的结所在；委中穴位于腘横纹的中点处，解剖位置在股二头肌肌腱与半腱肌肌腱之间，从脊髓节段角度而言，腰背部神经节段与委中穴的传入神经分布有相互重叠的部分，会互相影响。以上几点从中医角度说明“经脉所过，主治所及”的原则、特效穴和特殊穴的运用，以及从西医角度解释委中穴的解剖位置以及委中穴与腰痛神经节段的相关性，为临床治疗腰痛提供了可靠的依据。

综上所述，本实验研究表明，电针委中穴可以通过下调TGF-β1和CTGF的表达，同时增加Vimentin的表达，来促进损伤骨骼肌的修复，从肌纤维再生的角度说明，电针委中穴治疗骨骼肌损伤病变，最佳治疗时长可能是持续3 d，与肌肉纤维化相关的因子在此刻能得到最大效力的针刺抑制作用，此时骨骼肌修复的效果达到最优。