β-细辛醚对APP/PS1双转基因小鼠海马区突触蛋白PSD-95表达的影响

荣华 孙晓雪

由于人口老龄化趋势愈加严重，老年性疾病问题十分突出，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种严重危害老年人健康的疾病，它属于起病隐匿且病程缓慢的中枢神经退行性疾病，与人类机体衰老有十分密切的关系，已成为继肿瘤及心血管疾病之后危害老年人群健康最为严重的疾病以及造成死亡的原因[1]。现在针对AD 诊断，重要的病理特征表现为细胞外的老年斑及细胞内的纤维缠结，并且在脑组织中积聚大量的Aβ-蛋白，从而破坏神经突触的完整性和可塑性，使突触丢失及功能丧失[2，3]。痴呆早期明显的病理表现主要是突触的丢失，这说明它们之间有很大的关联性，并且突触发生损害同时也是记忆出现障碍的基础[4]。目前为止，医学上对AD 的治疗效果并不理想，不仅不能从根本上达到治疗疾病的效果，而且副作用较多。

通过现代药理学研究得知，中药石菖蒲有开窍豁痰、醒神益智、抗抑郁等作用，在临床中被经常用于AD、癫痫、脑中风等神经系统疾病的治疗[5]。其的主要成分为挥发油，而β-细辛醚是其中最主要的化学成分[6]。基于此，我们采用APP/PS1 双转基因小鼠模型，从突触可塑性角度来进行研究，探讨石菖蒲主要成分β-细辛醚对AD 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂β-细辛醚，天津一方科技有限公司（CAS：00011017-T9K）；盐酸多奈哌齐（donepezil hydrchloride tablets，DHT）卫材（中国）药业有限公司（CAS：C14200012042）；PSD-95 一 抗，美 国Cell Signaling Technology 公司（CAS：3409T）。

1.1.1 动物 2月龄APP/PS1 双转基因小鼠40 只，C57BL/6 小鼠10 只，南京大学-南京生物医药研究院提供，生产许可证编号：SCK（苏）2015-0001。

1.1.2 仪器设备 Stratagene Mx3005P 型实时荧光定量PCR（Real-time PCR）仪（美国Agilent 公司），S1000TM热循环仪（美国Bio-Rad 公司），XPE504 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司），AlphImagerTM图像分析系统（美国Alphaimager 公司）。

1.2 分组及给药随机将转基因小鼠分为模型组、盐酸多奈哌齐组（0.33mg·kg-1·d-1），β-细辛醚低剂量组（25mg·kg-1·d-1）、高剂量组（50mg·kg-1·d-1），同时选择C57BL/6 小鼠为空白对照组，与模型组给予等体积的生理盐水，连续4 周。

1.2.1 行为学检测 当给药周期结束后，应用Morris水迷宫方法对实验小鼠进行行为测试。直径为150cm，高60cm 的圆形不锈钢水池，内置高40cm无色有机玻璃平台。利用水迷宫的中心作为原点，在水池四周侧壁上标记东、西、南、北，作为进水点。将玻璃平台放入水中，注水，池内的水温要求达到（22±1）℃，加入适量奶粉，使水呈乳白色，安全平台要低于液面台要求1cm，练习期间周围环境要求保持安静，参照物不能改变。

1.2.2 定位巡航实验 实验时间为期5d，4 次/d，选取东侧作为入水点，自动摄像系统记录小鼠寻找到水下平台时间（逃避潜伏期），设定逃避潜伏期的时间为60s。

1.2.3 空间探索实验 当进行6d 定位航行实验结束后，将玻璃平台从乳白色水面移出，在相同进水点放入小鼠，记录小鼠在没有安全平台的情况下寻找记忆中平台的次数，设定时间为60s 内小鼠跨越平台位置的次数。

1.2.4 刚果红染色检测小鼠海马CA3 区Aβ-淀粉酶沉积的变化 配置刚果红染液：刚果红0.5g，甲醇溶液80ml。石蜡组织切片脱蜡至水化，刚果红染液室温孵育30min，分化液分化数秒，冲洗，苏木素复染2min，清水冲洗后进行梯度脱水，透明，封片，光学显微镜下观察拍照。

1.2.5 免疫荧光标记检测小鼠海马CA3 区PSD-95蛋白表达的变化 将冰冻的脑组织切片置于甲醇溶液中浸泡10min，滴加PBS 清洗液漂洗3 次，高压修复2min 后冷却至室温，37℃条件下免疫血清孵育20min，滴加适当比例稀释的一抗工作液，4℃过夜。次日，PBS 溶液冲洗切片后，滴加二抗工作液避光40min，封片，在荧光显微镜下观察拍照。

1.2.6 RT-PCR 检测各组小鼠海马PSD-95mRNA 的表达 给药结束后，冰上迅速取出脑组织，快速定位海马并进行剥离，将海马组织剪成乳糜状，按照比例要求，每50mg 海马组织加入1ml 的TRIzon 试剂，使用移液器将液体吸入到预先高压处理过的EP 管中。加入氯仿，每使用1ml 的TRIzon 试剂加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡20s，室温放置3min。加入DEPC水30µl，使RNA 充分溶解，配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，吸取2µl RNA 样品，加入1µl 的上样缓冲液，混匀加入配好的琼脂糖凝胶中进行电泳，鉴定所提取RNA 的纯度及完整性。在冰上配制反应体系试剂，按要求设置扩增条件：95℃ 30s；95℃ 5s；60℃ 31s；共40 个循环。引物序列如下：上游引物：5'-CACTGACAACCCGCACATC-3'；β-actin：上游引物：5'-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3'；下游引物：5'-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA -3'。反应结束后，进行数据的分析与处理，通过2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析，计量资料以±s表示，两组间用SNK 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-细辛醚对APP/PS1 双转基因小鼠学习记忆能力的影响药物治疗结束以后，通过水迷宫行为学检测发现，与空白对照组比较，模型组小鼠逃避潜伏期时间增加，对平台的跨越次数减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，盐酸多奈哌齐组与β-细辛醚各剂量组小鼠逃避潜伏期时间明显缩短，对平台跨越的次数增多，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠逃避潜伏期和跨越平台次数比较（±s）

表1 各组小鼠逃避潜伏期和跨越平台次数比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 n 逃避潜伏期（s） 跨越平台次数（次）空白对照组 10 9.33±1.59 5.93±0.50模型组 10 56.73±4.15a 1.67±0.31a盐酸多奈哌齐组 10 26.80±4.06b 4.13±0.12b β-细辛醚低剂量组 10 33.40±4.15b 3.27±0.31b β-细辛醚高剂量组 10 23.80±3.91b 5.07±0.23b

2.2 β-细辛醚对APP/PS1 双转基因小鼠海马CA3区Aβ-淀粉沉积的影响药物治疗结束以后，应用刚果红染色法检测每组小鼠海马CA3 区Aβ-淀粉样沉积的变化。结果显示，与空白对照相比较，模型组小鼠海马区Aβ-淀粉沉积明显增多，与模型组比较，β-细辛醚高低剂量组均可降低Aβ-淀粉沉积，而高剂量组治疗效果要好于低剂量组，且与阳性对照药物盐酸多奈哌齐作用相一致。见图1。

图1 各组小鼠海马CA3 区Aβ-淀粉沉积变化

2.3 各组小鼠海马CA3 区PSD-95 蛋白表达的变化给药结束后，采用免疫荧光技术标记突触功能可塑性相关蛋白PSD-95，检测β-细辛醚对蛋白的影响。结果显示，与空白对照组比较，模型组小鼠海马CA3 区的PSD-95 表达量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；β-细辛醚低剂量组、β-细辛醚高剂量组、盐酸多奈哌齐组与模型组相比较，表达量相对升高（P＜0.05），高剂量组作用效果好于低剂量组。见表2。

表2 各组小鼠海马CA3 区PSD-95 表达（±s）

表2 各组小鼠海马CA3 区PSD-95 表达（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 n PSD-95空白对照组 10 1.00±0.01模型组 10 0.59±0.06a盐酸多奈哌齐组 10 0.79±0.04b β-细辛醚低剂量组 10 0.70±0.05b β-细辛醚高剂量组 10 0.76±0.05b

2.4 各组小鼠海马CA3 区PSD-95mRNA 的表达在结束4 周给药治疗后，与空白对照组比较，模型组小鼠海马CA3 区PSD-95mRNA 表达下调，有显著差异（P＜0.05）；与模型组比较，β-细辛醚低剂量、β-细辛醚高剂量、盐酸多奈哌齐均能够上调PSD-95mRNA 的表达，且高剂量组效果好于低剂量组（P＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠海马区PSD-95mRNA 的表达（±s）

表3 各组小鼠海马区PSD-95mRNA 的表达（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 n PSD-95mRNA空白对照组 10 0.98±0.45模型组 10 0.45±0.10a盐酸多奈哌齐组 10 0.73±0.11b β-细辛醚低剂量组 10 0.69±0.05b β-细辛醚高剂量组 10 0.71±0.05b

3 讨论

老年痴呆症在人步入老年期间出现，表现为痴呆症状的所有疾病，因此它的发生与年龄相关，多在50 岁以后起病。此病发病的主要临床特征表现为记忆力减退，以及严重的认知障碍，并将会伴有不可逆的行为及社交障碍。随着病情加重会导致患者失去自主生活能力甚至会带来严重的并发症而致死亡[7]。

近年来对AD 的研究，国内外研究者提出诸多假说，研发出多种药物应用于临床治疗，但是到目前为止AD 发病机制并不十分明确，对于药物治疗效果也是差强人意。许多研究证实，在神经系统中，细胞间的联系主要是以突触的传递作用为基础，神经元对信号的接受与处理功能需要借助突触连接来实现，基于此它的损伤与缺失是影响认知功能的重要神经生物学因素之一[8，9]。神经系统的可塑性在很大程度上是由突触的形态结构、数量以及功能状态调节等方面决定的。

PSD-95 是突触后膜骨架蛋白及突触后致密物质的主要成分，稳定性非常高，它能够将信号分子、调节分子和靶分子联系起来，参与突触后膜受体的激活及下游信号的传导，在神经元对神经传导信号的应答过程中发挥重要作用[10～12]，同时PSD-95 能够接受和整合突触信号并将其传导给突触后细胞，作为突触后膜上的脚手架蛋白能够维持突触后膜结构的稳定，因此它在突触可塑性中有重要作用，而且也成为突触重建水平的重要检测标志[13]。

中医认为AD 的病位在脑。《本草备要》曰：“人之记性，皆在脑中……凡人外见一物，必有一形影留于脑中……今人每记忆往事，必目上瞪而思索之，此即凝神于脑之意也[14]。”中医早就已经认识到脑具有记忆、思维、感知功能，AD 的发生是由于脑萎缩，大脑功能退化所致。《本草备要》曰：“老人健忘者，脑渐空也。”《医林改错》更是认同“灵机记性在脑”、“脑气虚，脑缩小”、“高年无记性者，脑髓渐空[15]”。自古以来石菖蒲作为醒脑开窍类佳品，是应用于脑部疾病的中药方剂中出现频率非常之高的药物。近些年来，石菖蒲的化学成分、药理研究、临床应用等方面也有较系统的研究。

石菖蒲含挥发油（0.01%～2.15%）及糖类、机酸、氨基酸等。挥发油中含34 种成分，主要为β-细辛醚63.2%～81.2%、α-细辛醚3.4%～13.7%，其次为石竹、α-葎草烯、石菖醚、细辛醛等[16]。许多实验研究表明石菖蒲挥发油的有效成分有促进学习记忆的作用[17]。石菖蒲具有益智健脑、抗抑郁等作用，医学界经常用它治疗神魂癫痫、健忘、耳聋等神经系统疾病[18，19]。

本研究采用APP/PS1 双转基因小鼠作为研究对象，通过水迷宫实验来检测石菖蒲有效成分β-细辛醚对各组小鼠学习记忆能力的影响。实验结果显示，模型组小鼠寻找跨越安全平台次数明显减少，与此同时逃避潜伏期的时间有所增加，而β-细辛醚组痴呆小鼠这种反应迟钝的行为有所改善，小鼠跨越平台的次数明显增多，逃避潜伏期的时间有一定的缩短，显著提高小鼠学习记忆能力，说明β-细辛醚能够改善痴呆模型小鼠相似于AD 患者出现的行为学症状。刚果红染色检测得出结果提示，β-细辛醚可以降低小鼠脑中Aβ-淀粉样沉积，说明β-细辛醚可以缓解Aβ-淀粉酶诱导的突触可塑性功能障碍，并且能够在突触功能维持和改善中发挥一定的保护作用。

本研究发现β-细辛醚通过调节神经突触可塑性重要蛋白PSD-95 表达的变化，进而进一步研究药物治疗AD 的作用机制。通过免疫荧光结果可知，与空白对照组比较，模型组小鼠PSD-95 的蛋白表达相对降低，与模型组比较，β-细辛醚高剂量组更能明显升高转基因小鼠海马区PSD-95 的蛋白表达。RT-PCR 检测结果显示，β-细辛醚能够上调小鼠海马区PSD-95mRNA 的表达，进一步达到稳定突触连接，改善突触可塑性，恢复信号相关传递的功能。由此可以推断，β-细辛醚通过调节小鼠神经突触可塑性相关功能蛋白PSD-95 的变化来发挥抗AD 的作用，同时本研究也为寻找防治AD的新作用靶点的药物提供理论研究基础。