启膈散联合顺铂对与成纤维细胞共培养的食管癌EC9706细胞生长的影响

王朋辉，吴耀松，尚艺婉，孟丹华，李晨旭，李迎霞，杨联河，陈玉龙

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.洛阳市中医院，河南 洛阳 471000

食管癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在全球居第七位和第六位。我国每年约有26万食管癌新发病例。食管癌预后欠佳，五年生存率不到30%[1，2]。因此，深入研究食管癌发生发展分子机制，可为食管癌治疗提供思路及新靶点。目前，越来越多的学者在食管癌的诊疗中不仅关注食管癌细胞本身，更关注食管癌肿瘤微环境。肿瘤相关成纤维性细胞参与了肿瘤发展全过程，为食管癌细胞的增殖、侵袭等提供了适宜环境[3，4]。行气化痰法及其代表方启膈散在食管癌的治疗中运用广泛，本课题组前期研究显示启膈散联合顺铂有较显著的协同作用，能明显抑制食管癌EC9706细胞生长，促进食管癌EC9706细胞凋亡及增加S期的阻滞率[5，6]，但在与成纤维细胞共培养条件下启膈散是否仍具有很好的抑制食管癌细胞生长及与顺铂协同作用，仍未有相关研究报导。本文就此问题进行了研究，现报告如下。

1 材料

1.1 细胞株

食管癌EC9706细胞株由河南省方证信号传导重点实验室惠赠，人食管成纤维细胞HEF购自美国ScienCell细胞库（货号：#2730）

1.2 主要试剂

DMEM：F12=1∶1（中国 Boster公司批号20160522）、胎牛血清（美国Gemini公司，批号：A97E00G）、顺铂（美国Sigma公司，批号MKBG8465V），Annexin V-FITC/PI细胞双染凋亡检测试剂盒、PI周期试剂盒（杭州联科生物技术有限公司）。

1.3 仪器设备

倒置显微镜（德国Laica公司）、高压灭菌锅（日本ALP公司）、低速离心机（湖南湘仪有限公司）、ELx-800型酶标仪（美国BIO-TEK公司）、超净工作台（苏州安泰空气技术公司）、CO2培养箱德国（Eppendorf公司）、FACSVantage SE型流式细胞仪（美国BD公司）、高速低温离心机（美国Thermo公司）、紫外分光光度计（美国Thermo）。

2 方法

2.1 药物制备

实验药物启膈散参照《医学正传》组方，药物组成与比例：丹参︰沙参︰茯苓︰川贝母（去心）︰杵头糠︰砂仁壳︰郁金质量比为6︰6︰2︰3︰1︰1︰1；药材均购自北京同仁堂。药量按照上述比例称取每味药的对等克数，质量︰体积=1︰10，加入体积分数95%乙醇浸泡7 d，每日震荡2次混匀。旋转蒸发，浓缩药液，上述浓缩液与乙酸乙酯体积比为2︰1进行萃取；然后浓缩、低温真空干燥，最终出膏率为0.82%。二甲基亚砜（DMSO）充分溶解配置100 mg/mL的母液，0.22 μm过滤除菌，-20℃冰箱保存，备用。

2.2 细胞培养

将成纤维HEF和食管癌EC9796细胞于含10%胎牛血清的DMEM：F12=1︰1完全培养基。于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，2～3 d换液、传代。

2.3 启膈散和顺铂及两者联合对共培养条件下食管癌EC9706细胞增殖的影响

将食管癌EC9706细胞以6×104/孔接种于24孔Transwell细胞培养板下室，成纤维细胞HEF以3×104/孔接种于24孔Transwell细胞培养板上室，5%CO2培养箱中静置4h后将上室置于下室中，同时设置常规单独EC9706细胞培养组，每组3个复孔，培养48 h，MTT（MTT溶液终浓度：0.5 mg/mL），500 μL/孔，37 ℃CO2培养箱中避光孵育4h，吸出上清，加入DMSO（600 μL/孔）缓慢摇床摇动15 min，酶标仪570 nm处测吸光度OD值。实验重复3次。

以上条件，经浓度为10、20、40、80、160 μg/mL启膈散乙酸乙酯提取物或0.5、1、2、4、8 μg/mL的顺铂处理48 h后，MTT比色法检测不同培养条件下食管癌EC9706细胞对顺铂敏感性，概率法分别计算IC30及IC50值，。

启膈散和顺铂联合用药，分为单独顺铂IC30作用48h组，单独启膈散乙酸乙酯IC30作用48 h组，联合用药组（顺铂IC30先作用24 h后，再加入启膈散乙酸乙酯IC30作用24 h）。

2.4 PI染液法检测细胞周期

取常规培养对数生长期细胞，以3×106/瓶接种于10 cm2细胞瓶中，经不含血清的培养基同步化培养24 h。进行共培养和常规单独培养，条件如上，药物浓度同上。培养48 h后，收集食管癌细胞，PI染色30 min，过滤后流式细胞仪检测细胞周期。

2.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡

细胞培养及分组同2.4。培养48h后，收集食管癌细胞1×106mL-1，预冷的PBS洗2遍。细胞重悬于 500 μL BufferA 中，加入 5 μL PI和 5 μL Annexin V-FITC染液染色，室温孵育10～15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。凋亡率=处理组-对照组。

2.6 统计学处理

应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，若数据符合正态性分布，采用ANOVA方差分析，数据以（均数±标准差）表示，P＜0.05有统计学意义。

3 结果

3.1 启膈散乙酸乙酯对共培养条件下食管癌EC9706细胞活性影响（n=3，±s）

不同浓度启膈散乙酸乙酯部位提取物对共培养条件下食管癌EC9706细胞有明显的抑制作用和量效关系，成浓度剂量依赖性（P＜0.05）。

表1 启膈散乙酸乙酯对共培养条件下食管癌EC9706细胞活性影响（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表1 启膈散乙酸乙酯对共培养条件下食管癌EC9706细胞活性影响（n=3，±s）Table 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：与单独EC9706空白对照组比较，①P＜0.05

组别抑制率（%）0-4.03 24.45 26.90 44.66 69.15启膈散乙酸乙酯（μg/mL）0 10 20 40 80 160 24 h OD值48 h OD值1 2 3 4 5 6 0.83±0.01 0.79±0.02①0.76±0.05①0.67±0.02①0.45±0.15①0.27±0.07①抑制率（%）0 4.82 8.43 19.28 45.79 67.47 0.88±0.09 0.84±0.14 0.66±0.11①0.62±0.10①0.47±0.05①0.26±0.01①

图1 启膈散乙酸乙酯对共培养条件下食管癌EC9706细胞活性影响Figure 1 Effect of ethyl acetate extract of Qiqe Powder on EC9706 cell activity of esophageal carcinoma under co-culture

3.2 与成纤维细胞HEF共培养影响食管癌细胞EC9706对顺铂的敏感性

在顺铂相同浓度作用下，共培养条件下食管癌EC9706组的OD值明显高于单独培养食管癌EC9706组（P＜0.05）；单独培养IC50为2.63±0.38，共培养为3.41±0.33，共培养条件下顺铂的IC50值明显高于单独培养食管癌EC9706组（P＜0.05）。结果见图2。

表2 不同培养条件下顺铂对食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

表2 不同培养条件下顺铂对食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

注：与EC9706空白对照组比较，①P＜0.05；与单独EC9706培养条件组比较，②P＜0.05；A：单独EC9706组B：共培养条件组。

顺铂浓度（μg·mL-1）0 0.25 0.5 A组顺铂IC50 B组顺铂IC50 A组OD值0.48±0.06 0.46±0.02 0.44±0.07 0.38±0.12①0.27±0.02①0.08±0.01①B组OD值0.47±0.04 0.50±0.06 0.44±0.05①0.44±0.06①0.31±0.02①0.16±0.01①2.63±0.383.41±0.33②1 2 4

图2 ：不同培养条件下顺铂对食管癌EC9706的增殖抑制作用（n=3，±s）Figure 2 Inhibitory effect of cisplatin on proliferation of esophageal carcinoma EC9706 under different culture conditions（n=3，±s）

3.3 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞的抑制作用

与单独顺铂IC30作用48 h组相比较，联合用药组OD值明显减少（P＜0.05），联合用药有协同作用趋势，顺铂组、启膈散组、联合用药组对EC9706细胞的抑制率分别为22.97%、33.76%、46.35%。结果见表3

3.4 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对食管癌细胞EC9706的凋亡影响

与单独培养的EC9706组相比较，共培养条件组总凋亡率降低，结果具有统计学意义（P＜0.05），晚期凋亡率下降明显；与共培养模型组相比较，顺铂组明显使EC9706早期凋亡率增加，而启膈散乙酸乙酯组，联合用药组均使EC9706晚期凋亡率增加，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以联合用药组使EC9706晚期凋亡率增加明显（P＜0.05），但早期凋亡率差异不大，结果见表4，图4、6。

表3 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表3 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞的抑制作用（n=3，±s）Table 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：与单独EC9706空白对照组比较，①P＜0.05

组别空白对照组顺铂组启膈散组联合用药组OD值0.94±0.01 0.72±0.02①0.62±0.08①0.51±0.06①抑制率（%）0 22.97 33.76 46.35

图3 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞的抑制作用Figure 3 Inhibitory effect of ethyl acetate extract of Qige Powder and cisplatin on esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

3.5 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞周期的影响

与单独的EC9706组相比较，共培养模型组增加了S期的比例，结果具有统计学意义（P＜0.05）；与共培养模型组相比较，顺铂组，启膈散乙酸乙酯组及联合用药组明显降低了EC9706细胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706细胞S期的比例，差异有统计学意义（P＜0.05），其中以联合用药组作用最明显（P＜0.05）；结果见表5，图5、7。

4 讨论

在食管癌肿瘤微环境中，食管癌相关成纤维细胞中大量分泌的平滑肌激动蛋白和转化生长因子、IL-6，具有明显的促进肿瘤细胞发生发展的作用，能够促进食管癌细胞增殖及侵袭，其分子机制可能与食管癌耐药有关[7，8]。

表4 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞凋亡的影响（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

表4 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞凋亡的影响（n=3，±s）Table 4 Effect of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture condition（n=3，±s）

注：与单独EC9706组比较，①P＜0.05；与共培养条件模型组相比较，②P＜0.05

Control M D C CD2总凋亡率（%）33.51±3.11 21.04±8.03①35.30±12.89①②37.35±3.89②55.52±6.12②组别单独EC9706组共培养条件组顺铂组启膈散乙酸乙酯组联合用药组早期凋亡率（%）7.05±1.86 4.68±1.05 11.93±2.04②5.96±0.84 5.94±1.67晚期凋亡率（%）26.46±5.27 16.36±7.73 23.36±12.26 31.39±3.03②49.45±4.44②

图4 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞凋亡的影响Figure 4 Ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the influence of culture conditions of esophageal EC9706 cell apoptosis

图5 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞周期的影响Figure 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

表5 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞周期的影响（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

表5 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞周期的影响（n=3，±s）Table 5 Influence of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on EC9706 cell cycle of esophageal carcinoma under co-culture conditions（n=3，±s）

注：与单独EC9706组比较，①P＜0.05；与共培养条件模型组相比较，②P＜0.05。

Control M D C CD2 S期（%）33.53±3.30 35.08±1.70①50.01±6.71②67.58±6.71②76.58±1.07②组别单独EC9706组共培养条件组顺铂组启膈散组联合用药组G0/G1期（%）53.68±3.50 54.01±1.02 34.30±2.29②21.78±2.52②13.14±5.10②G2/M期（%）12.79±2.11 10.92±0.81 15.69±5.20 11.64±1.71 10.01±3.38

本文研究显示，食管成纤维细胞可以促进食管癌细胞增殖，是否也可降低食管癌细胞对顺铂的敏感性，有待探究。本研究比较了单独培养食管癌EC9706和成纤维细胞HEF与EC9706共培养条件下两种不同培养方式对顺铂的敏感性作用异同。发现在顺铂相同浓度作用下，共培养条件下食管癌EC9706组的OD值明显高于单独培养食管癌EC9706组，说明在共培养条件下成纤维细胞HEF介导了食管癌EC9706的耐药，降低了顺铂对食管癌EC9706细胞的敏感性，但其机制需要深入研究。

图6 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞凋亡的影响Figure 6 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on apoptosis of esophageal carcinoma EC9706 cells under co-culture conditions

图7 启膈散乙酸乙酯联合顺铂对共培养条件下食管癌EC9706细胞周期的影响Figure 7 Effects of ethyl acetate extract of Qige Powder combined with cisplatin on the cell cycle of esophageal carcinoma EC9706 under co-culture conditions

中医药有逆转肿瘤耐药和增加化疗药物敏感性的作用，而启膈散联合化疗可以起到增效减毒效应[9，10]。我们前期研究显示，在常氧和低氧情况下启膈散联合顺铂有明显的协同作用，能明显抑制食管癌EC9706细胞生长[5，6]。本文研究显示，启膈散乙酸乙酯部位联合顺铂可以更好地抑制与成纤维细胞共培养条件下肿瘤细胞生长，具有一定协同作用。

细胞凋亡障碍、凋亡抑制都会导致肿瘤的发生，因此直接诱导肿瘤细胞凋亡或通过拮抗凋亡抑制因子来诱导凋亡都是治疗肿瘤很好的切入点，包括启膈散在内的许多中药方剂也具有一定诱导肿瘤细胞凋亡作用[11-13]。本实验结果显示，与单独培养的食管癌EC9706组相比较，共培养条件组下调了总的凋亡率，以下调晚期凋亡率较为明显。启膈散联合顺铂比顺铂单独应用时凋亡率明显升高，启膈散在一定程度上能够增强顺铂诱导EC9706凋亡的能力，但是其机制还需后续实验来进行探讨。

细胞周期是细胞完成一次完整的有丝分裂的过程，主要分为间期G1期（前期准备合成DNA单倍体期）、S期（DNA合成期）、G2期（合成蛋白质完成DNA复制的二倍体期）、有丝分裂期M期和静息状态G0期。肿瘤细胞存在周期调节失衡，很多研究都有报道中药可以通过调节细胞周期起到治疗肿瘤中作用[11，14，15]。本研究显示，与单独的EC9706组相比较，共培养模型组上调了S期的比例，使细胞增殖更快。顺铂组，启膈散乙酸乙酯组及联合用药组明显降低了EC9706细胞G0/G1期的比例，而增加了EC9706细胞S期的比例。说明在S期受到了药物阻滞的影响。因此，启膈散乙酸乙酯部位增强EC9706细胞对顺铂的敏感性与该结果有关。

本研究结果提示，启膈散可抑制与成纤维细胞共培养条件下的食管癌细胞增殖、诱导凋亡，干预细胞周期，与顺铂联合应用，具有一定增效作用。