1,6二磷酸果糖联合高压氧对大鼠缺氧缺血性脑病的治疗①

孙昂昂，刘东璞，吕晋元

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

新生儿缺氧缺血性脑病是指在围产期缺氧引起的缺氧缺血性脑损伤，出现一系列脑病的表现[1]，是新生儿神经功能障碍及死亡的首要原因，可导致终身神经发育不良，如脑瘫、认知障碍和智力迟钝。有氧呼吸是脑的能量来源重要部分，新生儿脑的代谢最强，但糖含量很少，所以脑代谢最先受到缺氧的影响。1，6二磷酸果糖(Fructose 1,6 diphosphate，FDP)是糖酵解途径产生的葡萄糖代谢内源性中间体，能够改善细胞内线粒体能量代谢，稳定细胞膜，减少氧自由基产生，保护脑细胞。与常压氧相比，高压氧(Hyperbaric oxygen，HBO)可以为HIE脑组织提供足够的氧气。在许多实验性脑损伤的研究中，HBO治疗比常压氧能产生更好的结果，HBO被认为是治疗HIE较为有效的方案[2]。7d大鼠大脑发育与新生儿期相近，本实验观察FDP、HBO以及二者联合应用对HIE大鼠脑组织病理变化及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

出生7d SD大鼠60只(14～16)g，雌雄不限，由佳木斯大学实验动物中心提供，1,6二磷酸果糖，高压氧装置，兔抗鼠Bcl-2抗体、Bax抗体，莱卡光学显微镜。

1.2 分组

将60只大鼠随机分为假手术组(S组)、缺氧缺血组(HIE组)、1，6二磷酸果糖治疗组(F组)、高压氧治疗组(H组)、1，6二磷酸果糖联合高压氧治疗组(F+H组)。麻醉后参照改良Rice等[3]的方法，结扎双侧颈总动脉，置于厌氧罐中1h，制成HIE模型。如果小鼠动作缓慢，平衡性差，翻身困难，则认为模型的建立是成功的。S组，仅分离双侧颈总动脉。F组，予FDP 250mg-1·kg-1，腹腔注射。H组，予1 Kpa HPO 2h。F+H组，同时予以上2种干预。所有干预治疗每日进行1次连续治疗7d。术中、术后因出血、麻醉过深、母鼠咬死等原因死亡15只，HIE组5只最多，S组两只最少，最后45只完成实验。

1.3 体质量增长率测定

7d龄、14d龄分别称重大鼠并计算体质量增长率。体质量增长率=(14d龄体质量-7d龄体质量)÷7d龄体质量。

1.4 标本制作及形态学观察

14d龄时，麻醉后打开胸腔，剪开右心耳，心尖部插管，注入生理盐水，流出液清亮后，注入4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，固定、脱水、包埋、制作常规石蜡切片，HE染色观察脑组织形态学改变。

1.5 免疫组化法检测阳性细胞数

采用En Vision两步法检测Bcl-2、Bax蛋白表达，均定位在胞质，为棕黄色颗粒样着色。每组选取两张切片在400倍光学显微镜下随机选取6个视野计数阳性细胞数，采用IPP 6.0图像分析软件计数。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 体重增长率

14d 时，HIE组、F组、H组、F+H组体重低于S组(P<0.05)；与HIE组相比，F组、H组体重增长(P<0.05)；与F组相比，F+H组体重增长(P<0.05)；与H组相比，F+H组体重增长(P<0.05)；F组、H组体重增长差异无统计学意义(P>0.05)。HIE组体重增长率低于S组(P<0.05)；与HIE组相比，F组、H组体重增长率增加(P<0.05)；与F组相比，F+H组体重增长率增加(P<0.05)；与H组相比，F+H组体重增长率增加(P<0.05)；F组、H组体重增长率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 新生大鼠缺氧缺血组与治疗组体重增长情况

2.2 病理学改变

光镜观察：S组脑组织结构基本正常，细胞核膜完整、核仁清楚；HIE组神经元细胞数目减少，排列紊乱，Nissl小体消失，胞膜皱缩，胞质浓缩变暗，核固缩、深染，间质水肿；皮质、海马有胶质细胞增生，可见筛状软化灶、卫星现象；与HIE组相比，F组、H组、F+H组神经元损伤减轻；见图1。

S组 HIE组 F组

H组 F+H组

2.3 免疫组化结果

与S组相比，HIE组Bcl-2表达减少(P<0.05)，Bax表达增加(P<0.05)；F组、H组较HIE组Bc1-2表达均增加(P<0.05)，Bax表达减少(P< 0.05)；与F组相比，F+H组Bcl-2表达增加(P<0.05)，Bax表达减少(P<0.05)；与H组相比，F+H组Bcl-2表达增加(P<0.05)，Bax表达减少(P<0.05)；F组、H组Bcl-2、Bax表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2～3、表2。

S组 HIE组 F组

H组 F+H组

S组 HIE组 F组

H组 F+H组

表2 免疫组化检测大脑皮层凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达阳性细胞数

3 讨论

7d龄大鼠脑发育与人类的出生阶段相当，模拟新生儿HIE。新生儿HIE发病率很高，患病后如果无法得到及时治疗，会引起胎儿死亡[4]。能量衰竭是HIE发病机制的首发环节。脑组织供氧不足，无氧酵解导致乳酸堆积，使受损神经细胞不可逆损伤。凋亡过程可持续21d以上，及时阻断，可阻止神经细胞迟发性死亡，减少神经系统后遗症的发生[5]。恢复神经细胞正常能量代谢是治疗HIE的首要方法。FDP可跨越血脑屏障为缺氧组织提供能量来源，改善细胞代谢，促进缺氧细胞的恢复，对大脑、心肌细胞以及肝细胞等起到保护作用，已被证实在辅助治疗心肌受损性疾病方面确有疗效。

高压氧被证明在与一般缺氧及其相关的急性条件下是有益的，如一氧化碳中毒、循环停止和局部缺血缺氧。高压氧治疗有助于受影响的大脑的自我保护和恢复，并通过抑制线粒体依赖的细胞凋亡来保护大脑免受缺血损伤。高压氧治疗可减轻缺氧缺血引起的神经损伤，增强细胞凋亡的长期神经功能恢复[6]。高压氧治疗通过促进脑细胞增殖或抗凋亡和抗氧化应激具有神经保护作用[7]。 高压氧可以通过改善对血流减少区域的供氧来对抗缺氧；通过减少缺氧缺血，HBO减少了缺氧导致的所有病理事件，包括组织水肿、区域通透性增加、组织代谢后紊乱、炎症等。可能直接影响对氧或缺氧敏感的细胞凋亡、信号转导和基因表达。高压氧在细胞水平上提供了一个氧库，它不仅由血液携带，而且通过从组织间组织扩散而来，达到高浓度，可持续数小时，改善内皮功能和流变学，减少局部炎症和水肿。

Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促凋亡基因，Bcl-2和Bax的比例，是评价细胞凋亡程度的可靠指标。本研究表明治疗组Bcl-2表达增加，FDP与HBO联合应用明显增加，Bax表达减少，FDP与HBO联合应用明显减少。FDP与HBO联合应用，可以使HIE脑组织缺氧状态得到改善，减轻脑组织损伤，但机制还需要进一步研究。