高含固率木质纤维素厌氧发酵物总DNA的4种提取方法比较

马旭光，刘素君，江 滔，常佳丽，唐 琼

(乐山师范学院 化学学院，四川 乐山 614000)

厌氧发酵技术因能将农作物秸秆和禽畜粪便等农业纤维质固体废弃物转化为清洁能源生物天然气(经提纯后使甲烷含量>95%的沼气)而备受关注，同时对于推动我国循环农业的发展具有重要意义[1-2]。厌氧发酵产甲烷的本质是由水解、酸化、产乙酸细菌和产甲烷古菌等多种微生物协同作用将复杂的大分子有机物逐步分解转化为甲烷和二氧化碳的过程[3]。高含固率(发酵体系中固含物>10%)厌氧发酵技术较传统的低含固率发酵技术具有容积产气率高、沼液排放量小、能耗低等优点，目前已成为粪秸高效产甲烷领域的研究热点[4-5]。

认识厌氧发酵体系中功能性微生物群的构成、生长代谢规律及其生态生理学以达到定向调控厌氧发酵过程是该领域重要的研究方向之一[6-8]。近年来随着分子生物学技术的快速发展，尤其是宏基因组技术在揭示生物多样性领域中的广泛应用，使得从DNA水平对不可培养的微生物种类进行全面研究成为可能[9]。能否获得高质量的厌氧发酵物中微生物总DNA直接关系到分子技术分析结果的客观性和准确性。

目前从土壤、肠道、堆肥、发酵床垫料、厌氧颗粒污泥、沼液等环境样本中提取微生物总DNA的方法主要有十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)法，十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)法，SDS-CTAB结合法以及生物技术公司提供的试剂盒法[10-15]。笔者前期采用上述几种方法提取高含固率(>10%)的牛粪和玉米秸秆混合厌氧发酵物中微生物总DNA，质量均不高，导致在后续聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)中无法获得理想目的条带。究其原因，可能与高含固率木质纤维素物料在厌氧发酵过程中产生的大量腐殖酸、酚类、糖类以及杂蛋白等不利于PCR扩增的物质有关[16]。另外，高含固率粪秸厌氧发酵物较废水等液体厌氧发酵物具有质地不均一、微生物浓度低、杂质多等特点[17]，而且在厌氧发酵体系中木质纤维素底物主要靠吸附在其上的细菌通过分泌胞内酶来完成分解[18]，这些因素均会影响提取微生物总DNA的质量。但目前还见专一性提取高含固率纤维质厌氧发酵物中微生物总DNA方法的报道。

基于此，本研究针对该类样本的特点，在前人研究基础上，对传统的SDS-CATB法进行了改进，提取不同高含固率粪秸厌氧发酵物的微生物总DNA，并与常规的SDS法，SDS-CATB法和淤泥试剂盒法进行比较，通过定性分析DNA电泳条带、特异片段PCR扩增效果和定量分析DNA的纯度和浓度，评价该方法的有效性和稳定性，以期针对高含固率纤维质厌氧发酵物建立一种高效、低成本的微生物总DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 样本与前处理

样本来源：提取总DNA的样本为4种中温(37℃±1℃)批次厌氧发酵6 d的纤维质混合物：玉米秸秆和牛粪、油菜秸秆和牛粪、油菜秸秆和猪粪、油菜秸秆和鸡粪，均取自实验室正常产甲烷的批次厌氧反应器，含固率在12.3%～14.5%，其理化性质见表1。

表1 试验样品的理化性质

样本前处理方法：称取2 g左右(准确记录重量)上述粪秸发酵物于无菌的10 mL离心管中，5000 rpm冷冻离心10 min，弃上清液后往沉淀加入3～5倍TE buffer(pH值8.0)缓冲液，混匀后-40℃备用。

1.2 试验内容

先以玉米秸秆和牛粪混合发酵物(S1)为试验样本，分别用试剂盒法,SDS法,SDS-CTAB法和改进的SDS-CTAB法提取微生物总DNA，比较提取DNA的质量和PCR扩增效果，每个处理设3～4个重复；然后为了进一步验证改进SDS-CTAB法的有效性和稳定性，分别取1 g左右油菜秸秆和牛粪(S2)、油菜秸秆和猪粪(S3)、油菜秸秆和鸡粪(S3)的混合厌氧发酵物提取微生物总DNA进行复证研究，每个处理设3个重复。

1.2.1 试剂盒法

采用北京百泰克生物技术有限公司生产的粪便总DNA提取试剂盒(离心柱型)，具体操作方法见说明书。

1.2.2 SDS法

参照赵勇[19]等提取土壤微生物总DNA的方法。

1.2.3 SDS-CTAB法

参照刘云浩[13]等提取微生物发酵床垫料中微生物总DNA的方法。

1.2.4 改进的SDS-CATB法

1.2.4.1 样品表面微生物的洗脱方法

取上述-40℃保存的样品于室温融化后，加入2～3倍于提取物体积的林格氏液，涡旋混匀，5000 rpm离心10 min，弃上清液。反复以上步骤2～3次，离心的沉淀物用于下一步杂质的去除。

1.2.4.2 腐殖酸和杂蛋白质的去除方法

将1.2.4.1中获得的沉淀物中加入2～3倍于提取物体积的洗涤液，涡旋混匀，5000 rpm离心10 min，弃上清液。反复以上步骤，直至上清液清澈透明后，离心的沉淀物用于下一步DNA的提取。

1.2.4.3 微生物细胞壁的裂解方法

将1.2.4.2中经处理过的沉淀样品中加入1～2倍体积的SDS裂解液，100 μL的蛋白酶K，100 μL的溶菌酶，150 μL的复合纤维素酶，200 μL的异硫氰酸胍(GuSCN)洗液，涡旋混匀后，65℃水浴45 min。

1.2.4.4 微生物总DNA的沉淀和纯化方法

(1)将1.2.4.2中水浴后的样品5000 rpm离心10 min，用移液枪转移褐色上清液至10 mL灭菌离心管。

(2)根据转移上清液的体积，加入0.2倍体积的3M醋酸钠无菌溶液和1倍体积的10%聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)-8000无菌溶液，-20℃下静置30 min后，5000 prm离心10 min，弃上清液，留黄色沉淀。

(3)往留有黄色沉淀的离心管中加入1倍体积的CTAB裂解液，65℃水浴10 min后，迅速加入等体积氯仿：异戊醇(24∶1)，上下颠倒，轻轻混匀，5000 rpm离心10 min。

(4)将1.2.4.3中的上清液一次性转移至无菌的5 mL离心管中，加入等体积的10%PEG-8000溶液，置于4℃冰箱中8 h，沉淀DNA。

(5)将1.2.4.4中的提取物12000 rpm 离心10 min，弃上清液后加入500 μL的70%冰乙醇洗涤沉淀后，12000 rpm 离心10 min后弃上清液。

(6)将上述步骤(5)中的沉淀物于超净工作台吹干后，加入100 μL无菌超纯水溶解DNA，并保存于-40℃待后续分子生物学分析。

1.2.5 DNA定性检测方法

配置1.2%的琼脂糖凝胶，Goldview II核酸染料用量为琼脂糖凝胶溶液体积的0.2‰，DNA的检测量为5 μL，电泳缓冲液为1×TAE，电泳时间为20 min，100 V电压，超纯水脱色，在凝胶成像仪中于302 nm紫外线下检测并采集电泳图。

1.2.6 DNA纯度和定量检测方法

用紫外线分光光度计中检测提取DNA的A260/A280，A260/A230和浓度值。

1.2.7 16S rRNA基因的PCR扩增方法

提取DNA的细菌16S rRNA基因在PCR扩增仪中完成，引物为357F-GC和517R，由北京六合通经贸公司合成。引物357F-GC的序列为GC clamp-5’-CCTA CCTACGGGAGGCAGCAG-3’，其中GC-clamp序列为5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGG-3’，引物517R的序列为5’-ATTACCGCGG CTGCTGG-3’[20]。扩增反应体系为50 μL(见表2)，DNA marker分子量为2000 bp，模板DNA的浓度为10 ng·μL-1(可根据提取DNA的浓度进行适当倍数稀释)。扩增程序为：95℃预变性10 min，25个热循环(93℃变性1 min，48℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s)，最后72℃延伸5 min[21]。

表2 PCR反应体系(50 μL)的组成 (μL)

1.3 主要试剂和仪器

1.3.1 试验试剂

(1)林格氏液：NaCl 9 g，KCl 0.12 g，CaCl20.24 g, NaHCO30.2 g，充分溶解后，定容至1L[22]。

(2)TE buffer(pH值8.0)：取5 mL 1 mol·L-1的Tris-HCl Buffer(pH值8.0)和1 mL 0.5 mol·L-1EDTA(乙二胺四乙酸)(pH值8.0)用超纯水定容至500 mL。

(3)洗涤液(pH值10)：取50 mL 1mol·L-1Tris-HCl，40 mL 0.5 mol·L-1EDTA，5.844 g NaCl和10 g PVP-40(聚乙酸吡络烷酮)，用超纯水溶解、定容至1 L。

(4)SDS裂解液：取50 mL 1mol·L-1Tris-HCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA，7.305 g NaCl，20 g SDS，10 g PVP-40，用超纯水溶解，调pH值至8.0，定容至500 mL。

(5)GuSCN洗液(pH值6.4)：取10 mL 1mol·L-1Tris-HCl，59.08 g GuSCN，溶解调pH值至6.4，定容至100 mL。

(6)3 mol·L-1醋酸钠(NaOAc)溶液(pH值5.0)：取123.045 g NaOAc溶于450 mL去离子水后，加25 mL 冰醋酸，充分搅拌并定容至500 mL。

(7)CTAB裂解液：取50 mL 1 mol·L-1Tris-HCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA，40.908 g NaCl，10 g CTAB，10 g PVP-40，充分溶解后定容至500 mL。

(8)10%PEG-8000溶液：取50 g PEG-8000，70.128 g NaCl，用超纯水溶解、定容至1 L。

上述配置的试剂均需在121℃灭菌15 min，室温保存。所用的分子生物学等级试剂Tris base，Na2EDTA·H2O，PVP-40，SDS，GuSCN和PEG-8000以及蛋白酶K(产品货号：V900887)均购自Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，溶菌酶(CAS：9001-63-2)和复合纤维素酶(CAS：9012-54-8)定制自深圳市思美泉生物科技有限公司，其余试剂均为国产分析纯等级。

1.3.2 试验仪器

高速冷冻离心机(JIDI-16R，广州吉迪仪器有限公司)，超微量紫外分光光度计(MD2000D，Biofuture, Made in Britain)，电泳仪(DYY-8C，北京六一生物科技有限公司)，凝胶成像仪(新JY04S-3C，北京君意东方电泳设备有限公司)，16S rRNA PCR扩增仪(ProFlex PCR System, Life technologies, Made in Singapore)。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法的总DNA纯度和浓度

DNA的纯度和浓度是评价提取样本中总DNA质量的重要指标。一般而言，A260/A280表示DNA中蛋白质的纯度，该值越大，说明蛋白质的纯度越高[12]；A260/A30表示DNA中腐殖酸的含量，该值越大，说明腐殖酸污染越严重，对后续PCR反应越不利[23]；DNA的浓度表示样品中总DNA的得率，该值越大，说明提取的DNA得率越高，在后续分析中更能客观反应样品中的微生物多样性[24-25]。不同方法提取玉米秸秆与牛粪混合厌氧发酵物中微生物总DNA的纯度和浓度检测结果见表3。

表3 不同方法提取试验样品中微生物总DNA的纯度和浓度

由表3可知，4种方法获得同一样本中的总DNA纯度和浓度有明显差异。改进SDS-CATB法提取的质量最佳，A260/A280，A260/A230，浓度分别能达到1.8，1.7和114.5 ng·μL-1，均显著(P<0.05)高于其他3种方法，说明该方法提取的总DNA中蛋白质纯度最高，腐殖酸杂质最少，DNA得率也最高。一般认为，A260/280>1.7时，蛋白质较纯；A260/230>1.5时，腐殖酸杂质含量不会影响后续PCR反应[24]。粪便试剂盒法提取的A260/A280和A260/A230分别仅为1.16和0.74，说明该方法不适合提取高含固纤维质厌氧发酵物微生物总DNA。

改进SDS-CTAB法能获得高质量DNA的原因可能与采用PVP-40洗液除杂有关。有研究表明，在缓冲液中加入适量的高分子螯合物PVP能络合提取样本中的多酚和萜类物质，具有抗氧化作用，进而有效防止多酚氧化为醌类物质，以免提取液变成褐色而影响DNA的纯度[26-27]。在本实验提取过程中，发现未使用洗涤液的粪便试剂盒法、SDS法和SDS-CTAB法获得的DNA有不同程度发黄，说明在破壁前采用PVP-40洗液对去除样本中多酚、萜类和腐殖酸等杂质起到了关键作用。另外，改进SDS-CTAB法有较高DNA得率的原因可能与采用林格氏液洗脱和多种酶破壁充分释放细胞中DNA有关。

2.2 不同提取方法的总DNA和PCR产物琼脂糖凝胶电泳效果

4种方法提取的总DNA琼脂糖凝胶电泳检测见图1。由图1可知，4种方法提取样品总DNA电泳检测结果有明显不同。改进SDS-CTAB法(12～15泳道)获得总DNA的电泳条带单一明亮、干净齐整，无明显DNA降解现象，而其他3种方法的条带均存在不同程度的拖尾和弥散现象，其中试剂盒法(1～4泳道)和SDS法(5～8泳道)尤为严重，说明在提取该样品总DNA时有大量DNA断裂碎片产生，难以获得完整的DNA。另外，粪便试剂盒法的条带亮度明显低于其他3中方法，这是由于试剂盒法由于受离心管容量的限制样本承载量为0.5 g左右，仅为其他3种手提法的1/4，且使用了纯化柱纯化DNA，可能导致总DNA的损失[24]。DNA琼脂糖电泳定性分析结果与表2中超微量紫外分光光度计定量分析结果相吻合。

注：泳道1～4为粪便试剂盒法；5～8为SDS法；9～11为SDS-CTAB法；12～15为改进SDS-CTAB法。

4种方法提取总DNA的PCR产物凝胶电泳检测见图2。由图2可知，改进SDS-CTAB法获得的目的条带(1～3泳道)清晰、明亮，SDS-CTAB法虽然也检测到了扩增目的条带(4～6泳道)，但仅隐约可见，清晰度低；而SDS法(7～9泳道)和试剂盒法(10～12泳道)均未检测到目的条带。由于4种方法提取的总DNA浓度均能满足PCR模板DNA适宜的浓度范围(5～10 ng·μL-1)。由此推测，能否获得PCR扩增目的条带与DNA的质量密切相关。由表3可知，粪便试剂盒法和SDS法的A260/A280和A260/A230均较低，说明DNA中较低的蛋白质纯度和较高的腐殖酸含量等杂质抑制了PCR反应。

注：M为DL 2000分子量的marker；泳道1～3为改进SDS-CTAB法；4～6为SDS-CTAB法；7～9为SDS法；10～12粪便试剂盒法。

2.3 改进SDS-CTAB法提取不同样品的总DNA纯度和浓度

上述实验结果表明，改进SDS-CTAB法提取高含固率木质纤维素厌氧发酵物料总DNA质量最高，能获得理想的PCR扩增目的条带，但与商业试剂盒法相比，样本承载量较高(2 g左右)，在前期洗脱和除杂阶段所耗时间较长，导致日提取样本数量有限。为此，将该方法样本承载量降低至1 g左右，洗脱液和洗涤液添加量均提高至提取物体积的5倍，提取3种木质纤维素厌氧发酵物样本(油菜秸秆+牛粪、油菜秸秆+猪粪、油菜秸秆+鸡粪)总DNA，其纯度和浓度结果见表4。

表4 改进SDS-CTAB法提取不同厌氧发酵物中微生物总DNA的纯度和浓度

由表4可知，改进SDS-CTAB法提取不同样品获得的总DNA质量均较高，A260/A280和A260/A230均分别大于1.70和1.60，说明蛋白质纯度较高，腐殖酸含量较少；总DNA的浓度均大于50 ng·μL-1，DNA得率也均较高。另外，在提取DNA过程中，发现通过减少样本承载量，可有效缩短前期洗脱和洗涤时间，进而提高了该方法的日提取样本数量。

2.4 改进SDS-CTAB法提取不同样本的总DNA和PCR产物电泳效果

改进SDS-CTAB法提取3种不同样本总DNA的琼脂凝胶电泳和PCR产物电泳定性检测结果见图3。由图3可知，不同样本总DNA的电泳条带均单一整齐、干净明亮，DNA均较完整，未见明显的断裂和降解；获得的PCR产物目的条带清晰齐整，能满足微生物多样性的后续分析要求。由此表明，针对不同高含固率木质纤维素厌氧发酵物，采用本研究提出的改进SDS-CTAB法提取的总DNA均纯度高、杂质少，性能稳定可靠，适合进一步推广应用。

注：图3中的1～3为油菜秸秆+牛粪，4～6为油菜秸秆+猪粪，7～9为油菜秸秆+鸡粪。

注：图4中M为DL 2000分子量的marker；泳道编号代表的样本与图3相同。

3 讨论

影响环境样本微生物总DNA提取质量的因素较多，尤其是如何有效去除样本中的残渣、多糖、酚类、色素和腐殖酸等杂质对获得高质量的DNA至关重要[11,23,26]。目前通常采用先富集微生物(细胞)再破壁和先破壁再离心以及化学试剂沉淀分离DNA两种方法。Tang[23]等使用CTAB法提取粪便中微生物DNA时采用先除杂、富集微生物然后用破壁的方法，除杂效果较高且提高了DNA得率；陈竞[15]等也采用类似的方法获得了得率和质量均较高的羊粪沼液中的微生物总DNA。先破壁再纯化的提取策略虽能提高DNA得率但因除杂能力有限会影响提取的质量[27]，因此该方法更适用于微生物浓度较高、杂质较少的样本。鉴于高含固率木质纤维素物料具有微生物浓度低、杂质多以及木质纤维素表面吸附有大量细菌群的特点，本研究采用先富集微生物(细胞)再破壁的提取方案，先用中性的林格氏液洗脱吸附在物料表面的微生物，以达到富集的目的，然后采用PVP-40洗涤除杂，以达到除杂的目的。研究表明，高分子螯合剂PVP能络合样本中的多酚、萜类物质，以及能有效防止多酚物质氧化成醌类物质而使提取变成黄色[13]；高盐溶液能降低腐殖酸和多糖对DNA的干扰[12]，PEG8000也能有效减少腐殖酸和杂蛋白对DNA的污染[13]。由此可知，本研究在后续提取步骤中使用的10% PEG8000,醋酸钠溶液和CTAB裂解液也起到了一定除杂作用。

另外，大量研究表明微生物细胞破壁方法也对DNA的得率和质量有明显影响[13-15]。目前通常采用物理法(冻融和机械震荡等)、化学法(SDS裂解液)和生物法(溶菌酶、蛋白酶等)裂解细胞壁，一般在实际操作中为了提高DNA得率综合使用上述几种破壁方法。温洪宇[28]等的优化结果表明，冻融和SDS法联合破壁最适合提取乳品废水活性污泥，张琳[29]等等在提取厌氧发酵活性污泥时认为溶菌酶等生物法的破壁获得的DNA片段长，能提高DNA得率和PCR扩增效率。鉴于本研究采用的样品木质纤维素厌氧发酵物存在大量细胞壁较厚且致密紧实的革兰氏阳性(G+)微生物，故采用了以生物法(裂解液、蛋白酶K、溶菌酶和复合纤维素酶)为主和化学法SDS为辅联合裂解破壁的措施并取得理想的DNA提取效果。

综上所述，在选用微生物DNA提取方法时不能一概而论，而应在分析提取样本的特性基础上，有针对性地选择或改进现有的方法，以达到理想的提取效果。高含固率木质纤维素厌氧发酵物与废水厌氧活性污泥、好氧发酵物以及土壤和肠道微生物等环境样本相比有其自身特殊性，难以用上述样本成熟的提取DNA方法。本研究针对影响DNA提取质量的关键步骤提出了改进SDS-CTAB法，通过林格氏液洗脱和PVP-40洗涤液除杂以及裂解液和多种生物酶联合破壁等系列方法，获得了质量较高的高含固率木质纤维素素厌氧发酵物总DNA。尽管手提法与商业试剂盒法相比，各提取步骤所使用的试剂成分明确且成本较低，但手提法日提取样本量较少，不便于批量化和标准化操作。因此，今后针对本研究针对上述关键步骤，还需从样本承载量、主要试剂的用量及其对微生物多样性的影响等方面进一步优化以达到该方法标准化、商业化应用的目的。

4 结论

(1)针对不同的高含固率木质纤维素厌氧发酵物，改进SDS-CTAB法提取的微生物总DNA的A260/A280和A260/A230值能分别达到1.70和1.60以上，每克样本的DNA浓度能达到50 ng·μL-1以上，蛋白质纯度高、杂质少，稳定性好。

(2)改进SDS-CATB法的微生物总DNA电泳条带单一齐整、清晰明亮，获得的PCR扩增目的条带清晰度高，适宜后续利用分子生物技术进一步分析微生物多样性及其代谢功能。

(3)林格氏液洗脱，PVP-40洗涤液除杂以及裂解液和多种酶联合破壁是改进SDS-CTAB法获得高质量微生物总DNA的关键步骤。