沼渣生物菌肥改良2,4-二氯苯酚污染土壤急性毒性和健康风险研究

孔 萌，黄 彬，石剑飞，彭明国，何 方，毛林强，张文艺

(1.常州大学 环境与安全工程学院，江苏 常州 213164；2.江苏中东化肥股份有限公司，江苏 常州 213153；3.武农生态能源有限公司，江苏 常州 213165)

氯酚类化合物是一种具有“致癌、致畸、致突变”效应的持久性有机污染物，广泛存在于土壤、地表水、地下水中，其潜在风险备受关注。农药及化学肥料的肆意使用，严重影响了土壤的微生态环境，加上我国大多数地区作物连作制度，致使土壤板结、营养元素亏缺、质地恶化、微生物群落变迁等情况日益严重。近年来，处理氯酚类化合物污染的方法主要集中在生物处理技术、物理化学法、化学还原法和化学氧化法[1]。其中微生物修复有机氯农药污染土壤具有成本低、修复效率高、二次污染效应小等特点，受到广泛的关注[2]。唐晨[3]归纳讨论了生物降解酚类化合物的机制及影响因素，而范燕燕[4]的研究则证实了微生物降解氯酚类化合物的有效性。沼渣除了含有大量的氮、磷、钾营养元素还有植物生长必须的氨基酸、生长素、腐殖酸等，不仅对提高作物产量和品质有良好的作用[5-7]，还能够改良土壤的理化性质[8-9]，增加微生物的活性。本课题组前期将微生物与沼渣结合制备出沼渣生物菌肥[10-11]，对2,4-DCP污染土壤具有较好的改良效果。

钱家忠、董继元等曾研究沼液对水环境潜在的生态危害进行了健康风险评价[12-14]，但对于农田土壤污染潜在的人群健康风险评估的研究尚未见报导。生物毒性检测是一种化学污染物检测的补充[15]，可以有效直观的反映受污染土壤毒性，从而体现污染物对于人类健康和生态环境的影响。有研究对废弃农药厂污染场地土壤浸出液进行生物毒性检测证明生物毒性测试法可以运用于污染土壤浸出液的毒性评价[16]。美国环境保护所(USPEA)健康风险评价模型曾被用于评价镉污染对不同人群暴露的健康风险[17]。为了确保居民的健康与安全，对改良土壤进行生物毒性检测和健康风险评价是十分有必要的。目前，国内外大多研究集中于沼渣作为有机肥对土壤养分含量、生态结构的影响，但对生物菌剂协同沼渣制备生物菌有机复合肥，对降解农药污染土壤毒性报道较少。本课题组基于生物菌-沼渣协同改良受污染土壤研究基础，对修复后的土壤进行急性毒性与健康风险评价研究。

本研究以受2,4-DCP污染的农田土壤为研究对象，通过添加本课题组制备的HD-1沼渣生物菌肥和菌液[18]，利用发光菌法对改良后土壤浸提液毒性以及土壤中种植的水稻、花生果实浸提液毒性进行分析，考察施用生物菌有机复合肥对改良后农田土壤对人群健康风险评估的影响，为农药污染土壤的改良和生态系统的构建提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与材料

菌种来源：农残降解菌HD-1筛选自南京某废弃农药厂的土壤中，是一株具有降解2,4-DCP能力的菌，经过理化特性和分子鉴定判断属于摩式假单胞菌。现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号：CGMCC NO.15123。

LB培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1 L，pH值7.0，121℃，100 kPa上海申安立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50KBS)高温灭菌20 min后使用。

干燥污泥磷酸铵镁(MgNH4PO4·6H2O简称MAP)：将分散式养猪场沼液通过磷酸铵镁结晶法制备MAP[10]。

改性沸石：采用经NaCl溶液改性后的斜发沸石，理化参数：粒径1～3 mm，孔隙率30%～40%，比表面积25～35 m2·g-1，平均吸附孔径4.36 nm。将改性后的斜发沸石对MAP结晶法处理后的沼液进行吸附，吸附比10 g·100 mL-1，得到含氮、磷的斜发沸石。

沼渣：将分散式养猪场沼渣进行150℃高温干燥72 h，剔除杂质，使用上海福絮鼓风干燥箱(DHG-9620A)达到干燥效果。

包膜材料：取一定量蒸馏水加热至约90℃后加入聚乙烯醇不停搅拌，保温搅拌至其完全溶解，制备质量分数为8%的聚乙烯醇溶液，密封保存冷却至室温。

1.2 菌液和菌肥的制备

(1)HD-1菌液制备：将配置好的LB培养基放入高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20 min，待冷却到约30℃时，将菌种转接至培养基中，于30℃，130 r·min-1上海一恒恒温振荡培养箱(HZQ-X100A)中震荡3 d。

(2)沼渣生物菌肥的制备：将上述MAP，改性沸石，沼渣进行研磨，并过60目筛网。将1 gMAP，4 g改性沸石，25 g沼渣与对数生长期的HD-1菌液混合、造粒，控制粒径范围4～6 mm,使得有效活菌数大于0.2 cfu·g-1，再将6.0 mL 8%聚乙烯醇作为封面材料均匀包裹在复混肥表面，复混比0.2 mL·g-1，待35℃烘干后为生物菌复混肥成品。

(3)模拟2,4-DCP受污染土壤：取适量未灭菌农田土，自然风干，过60目筛，制备2,4-DCP浓度为30 mg·kg-1。

1.3 发光细菌急性毒性测定

(1)取两份400 g 2,4-DCP浓度为30 mg·kg-1的土壤，其中一份加入267 mL的HD-1菌液及10 g沼渣生物菌肥，另一份为空白，使得含水率为40%，每隔两天取10 g土壤于50 mL离心管中，加入40 mL蒸馏水，超声波提取30 min，4000 r·min-1条件下离心20 min，取上清液过0.45 μm针孔过滤器，得到不同时间段的浸提液样品。超声波提取使用宁波新芝超声波清洗机(SB-5200D)，离心机使用金坛市杰瑞尔台式大型离心机(XYJ-A)。

(2)将在施加30 g沼渣生物菌肥的土壤里种植的盆栽水稻、花生果实碾碎分别取5 g浸入100 mL无菌蒸馏水中，超声波萃取30 min，4000 r·min-1条件下离心20 min，取上清液过0.45 μm针孔过滤器，得到果实浸提液样品。

将浸提样品分别通过北京金达JQ LID-P1发光细菌毒性检测分析仪检测，测定结果以抑光率公式(1)表示：

1.4 盆栽实验栽种

盆栽实验农作物有水稻、玉米、花生、红薯等，盆栽分别施加市售复合肥和沼渣生物菌肥，并设置平行对照组。盆栽实验在室外进行，种植农作物的器皿为陶瓷盆，土壤层厚度为25 cm，农作物秧苗采自常州市洛阳镇农田。实验前期对每盆盆栽施加30 g基肥，中后期(1～3个月)对照盆栽每10 d施加沼渣生物菌肥、市售复合肥15 g，施加4次。

1.5 土壤样品主要污染物产物检测

2,4-DCP在土壤中浓度的测定：配置一定浓度的2,4-DCP土壤，搅拌均匀后，取10 g土壤于50 mL离心管中，加入一定量的蒸馏水使其含水率为40%，超声波提取30 min，4000 r·min-1条件下离心20 min，取上清液过0.45 μm针孔过滤器，转入试剂瓶通过日本岛津紫外分光光度计(UV1800)检测。

菌种在土壤中降解能力的测定：取200 g土壤加入135 mL菌液，保持含水率为40%，不加菌做空白样，按照土壤测定方法每天检测。

南京索益盟检测技术有限公司检测土壤中污染物方法：气相色谱气质联用法测土壤中的酚类化合物[19-20]。

1.6 污染土壤健康风险模型构建

土壤中污染物进入人体主要暴露途径有皮肤接触、呼吸摄入及经口摄入。不同污染物经过不同途径对人体产生危害所引起的健康风险模型分为致癌物健康风险模型和非致癌物健康风险模型[21-24]。

根据《污染场地风险评估技术导则》，污染物致癌风险为10-6，非致癌风险危害商值为1。

1.7 数据统计

实验数据运用origin9.0软件进行统计。

2 结果与讨论

2.1 HD-1在土壤中降解性能研究

模拟受污染土壤加入新鲜制备过夜的HD-1菌液，保持土壤含水率为40%，不加菌剂空白对照组，每隔2 d取10 g土测定2,4-DCP在土壤中的残余浓度。本实验设置不加菌剂空白组，以相同时间处理土壤，不投加HD-1菌的受污染土壤经10d改良后，土壤中的2,4-DCP降解率为23.09%，浓度从28.42 mg·kg-1降低到23.25 mg·kg-1，投加HD-1菌的受污染土壤经过10 d改良后，降解率为64.16%，残余浓度由28.01 mg·kg-1降为10.83 mg·kg-1。将投加HD-1菌的受污染土壤又自然降解20 d委托南京索益盟检测技术有限公司进行检测，检测2,4-DCP浓度为8.01 mg·kg-1。实验证明，本文所筛选出的HD-1降解菌可有效修复2,4-DCP污染土壤。

当农药浓度过高时，微生物降解农药会发生吸附和解析过程，即菌株降解农药时，会将药剂先吸附到菌体表面，再转移至菌体体内进行降解，当菌体体内农药积攒浓度过高时，菌体自身会开启保护机能，将农药排斥出去，防止自身受到伤害，同时代谢产物也会使菌体产生生物毒性，从而导致农药降解率逐渐下降[25](如图1)。

图1 加菌与未加菌对土壤中2,4-DCP的降解效果

2.2 施加菌液后土壤浸提液急性毒性分析

发光细菌是一类在正常生理条件下可以发射荧光的细菌，用于监测样品中毒性的一种生物测试技术。运用具有发光特性的天然微生物，样品中的毒性物质具有抑制微生物发光的作用，毒性越强这种抑制作用越明显。韦淑稳[26]等曾用发光细菌法用于检测农药污染毒性，并提出了发光细菌法在农药与其他多重污染物毒性检测中的应用前景。发光细菌急性毒性评价标准依据南京土壤研究所推荐的百分数等级分数标准见表1[27]。

表1 发光细菌急性毒性评价标准

图2显示了经过15 min浸提之后受污染原土、未稀释和稀释10倍的土壤浸提液对发光细菌发光抑制情况，由该图可以看出施加菌液后的土壤随时间的增加，其浸提液都对发光细菌的抑制效果呈减弱趋势，未稀释的浸提液在第2天抑光率高达88.14%，稀释后的浸提液抑光率为67.17%，未稀释和稀释10倍的浸提液在10 d内抑光率分别下降到了56.65%和40.19%，自然降解的土壤浸提液其抑光率由89.41%降低到84.50%，抑光率变化不大。施加菌液10 d后的土壤浸提液样品毒性仍为重毒标准，受污染原土浸提液毒性为剧毒标准。在第8天之前，施加菌液土的抑光率变化不大，第8天到第10天变化明显，与HD-1菌降解效果变化基本吻合。由此可知，HD-1降解菌有效降解2,4-DCP后，对土壤毒性起到了降低的作用，证实了HD-1降解菌的有效性。

图2 土壤样品浸提液急性毒性

2.3 农作物果实浸提液发光细菌毒性分析

盆栽实验种植农作物有水稻、玉米、花生、红薯等，选取具有代表性的水稻(桔杆果实)和花生(生长在土壤中根茎果实)进行果实浸提液发光细菌毒性分析。在分别施加市售复合肥和沼渣生物菌肥的模拟受2,4-DCP污染土壤中种植水稻与花生，果实成熟后对果实长势对比，果实浸提液进行发光细菌毒性分析。由表2可以看出，2,4-DCP污染土壤盆栽实验中施加市售的复合肥的水稻长势略好，花生长势相差无几。盆栽果实浸提液样品急性毒性检测结果显示，水稻、花生的浸提液相对发光率均大于90%，毒性级别为无毒。施加沼渣生物菌肥的盆栽水稻果实相对发光率大于施加市售复合肥的盆栽，由此可知，水稻与沼渣生物菌肥联合对受2,4-DCP污染土壤的降解效果相对较好，盆栽花生中土壤降解效果相对较差。可以推测到，水稻水生的生长环境更加适合沼渣生物菌肥的释放作用。水中的微生物群落更加均匀而又丰富，使得沼渣生物菌肥的效果更佳[28]。

表2 盆栽农作物生长情况、果实浸提液相对发光率及毒性级别

2.4 改良后土壤样品主要污染物产物分析

将施加菌液后的模拟受污染土壤样品送至南京索益盟检测技术有限公司检测，检测主要污染物如表3所示，检出污染物37种，检出率71.15%，主要高浓度的污染物有苯酚、萘、2,4-DCP、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯、邻苯二甲酸二丁酯、菲、芘等。其中大多数污染物质具有致癌危险，因此需对污染的农田土壤进行毒性分析及健康风险评估。改良后污染物中大部分得到有效降低，而邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯和邻苯二甲酸二丁酯浓度变高。邻苯二甲酸二甲酯毒性等级为低毒，还未有中毒报道，动物经口剂量大时对肠道等有刺激作用，对皮肤无刺激和致敏作用。邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯毒性等级为中毒，口服-大鼠LD50: 30000 mg·kg-1;口服-小鼠LD50: 1500mg·kg-1，皮肤-兔:500 mg·24 h-1为轻度; 眼睛-兔:500 mg轻度。邻苯二甲酸二丁酯，毒性分级为中毒，可引起轻度致敏作用，具有中等程度的蓄积作用和轻度刺激作用。受污染土壤经过改良后污染物浓度大幅度降低，使得受污染土壤对环境影响减小，由此可知，HD-1菌不仅对土壤中的2,4-DCP具有有效的降解能力，对苯酚等高毒污染物也具有降解效果，对萘、菲等低毒污染物也具有一定的降解能力。

表3 土壤样品中有机污染物种类及浓度 (μg·kg-1)

2.5 2,4-DCP污染土壤健康风险评价

部分高浓度半挥发性有机物通过不同途径对人体健康造成的风险高低依次为：经口摄入>皮肤接触>呼吸摄入。以模拟受2,4-DCP污染农田土为研究目标，部分高浓度污染物致癌、非致癌风险指数见表4，土壤中2,4-DCP，2,6-二硝基甲苯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯浓度较高对人体健康危害相对突出。通常认为致癌风险大于10-6，非致癌危害商值大于1，会对人体产生健康风险[26]，2,4-DCP经口摄入、皮肤接触、呼吸摄入土壤非致癌风险分别为2.31×10-2，1.26×10-2，1.61×10-5小于非致癌危害商值1，邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌风险为2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于致癌可接受水平10-6，表明经过菌液改良后的农田土，致癌和非致癌风险极小，为可接受水平，即对受污染农田土进行菌液改良的效果显著。

表4 部分高浓度污染物致癌、非致癌风险指数

3 结论

(1)施加菌液后受2,4-DCP污染土壤浸提液急性毒性降低明显，原土浸提液毒性为剧毒，施加菌液改良的土壤经过10 d降解后，土壤浸提液毒性等级降低到重毒，在施加沼渣生物菌肥土壤中种植的水稻和花生果实浸提液毒性等级为无毒。HD-1菌可以降低土壤中2,4-DCP浓度，水稻与沼渣生物菌肥协同对受2,4-DCP污染土壤的降解效果更好，土壤毒性解毒效果更佳。

(2)依据构建的致癌和非致癌健康风险模型，施加菌液改良后的农田污染土高浓度污染物2,4-DCP、2,6-二硝基甲苯、邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯的致癌风险分别为2.74×10-8，1.5×10-8，2.15×10-10小于10-6即为可接受水平，非致癌危害商值小于1，致癌和非致癌风险极小。沼渣生物菌肥可用于改良2,4-二氯苯酚污染土壤。