自然风干对马铃薯茎叶成分及厌氧发酵产沼气性能影响的研究

付龙云，李 彦，王艳芹，赵自超，张英鹏，田 叶，张宗东

(1.山东省农业科学院农业资源与环境研究所，济南 250100；2.农业农村部山东耕地保育科学观测实验站，济南 250100；3.烟台市农业综合执法支队，山东 烟台 264001)

马铃薯是世界五大粮食作物之一，单产量高且具有耐贮存、耐贫瘠、抗旱、抗寒等优良特性，在世界范围内有着广泛的种植，是部分国家人们餐桌上的主食[1]。自明朝中晚期引入我国以来，历经400余年发展，马铃薯已成为仅次于水稻、玉米、小麦的第四大粮食作物，播种面积和产量均居世界首位[2-3]。马铃薯不但可以作为主粮或蔬菜食用，而且还可是淀粉、乙醇等大宗产品的原料和优质的动物饲料，推动马铃薯产业发展对于保证国家粮食安全、优化种植结构、增加农民收入等均具有十分重要的意义。

营养性块茎是马铃薯的主要可食用部分，而茎、叶等地上部分的生物量约与块茎相当，富含蛋白质、糖类等，其合理利用不但具有可观的经济效益，而且具有良好的生态和环保效益。目前，马铃薯茎叶的利用途径主要有饲料化、材料化和能源化等方式。马铃薯茎叶营养较为丰富，具有一定饲用价值，但实践中需要解决适口性差、易腐烂和龙葵素的毒性等问题：何志军[4]等将马铃薯茎叶与小麦秸秆、玉米秸秆等混合后青贮，提高了马铃薯茎叶的青贮品质和适口性；杨永在[5]等发现将马铃薯茎叶与全株玉米按一定比例混合后青贮，或添加6%的糖蜜后青贮，均能降低马铃薯茎叶中有毒的龙葵素含量，提高青贮品质和饲用价值。马铃薯茎叶中含有0.1%～1%的茄尼醇，且相对于烟草等其它材料价廉易得，可用于茄尼醇等重要生化原料的提取[6-7]。马铃薯茎叶的能源化利用方式则主要是厌氧发酵生产沼气，目前的研究报道主要集中在通过物料混合或预处理的手段提高产气效率方面：Ashekuzzaman S M[8]等比较了马铃薯茎等植物原料单独发酵及与牛粪混合发酵产沼气效率差异，发现混合发酵时沼气和甲烷产量显著增加，并认为混合发酵体系可避免氨积累、挥发性脂肪酸过剩等问题，同时营养更均衡；周彦峰[9]等利用稀释100倍的木醋液对马铃薯茎叶进行预处理，促进茎叶中纤维成分的降解，提高了产沼气效率；葛一洪[10]等则以多种不同的离子液体处理马铃薯茎叶，可明显缩短厌氧消化启动停滞期，提高产沼气量和甲烷体积分数。相较于其它处理方式，厌氧沼气发酵对原材料的纯度、卫生等要求较低，适用地域更加广阔，在产出沼气的同时产生有肥料利用价值的沼渣、沼液，可同时实现废弃物的能源化与肥料化利用，尤其适合在马铃薯集中种植区进行推广。

作为马铃薯种植的副产品，茎叶部分在块茎收获以后往往会被暂时搁置在田间地头。同其它植物生物质材料类似，随时间推移植株会逐渐风干失水，可溶性碳水化合物(Water Soluble Carbohydrate，WSC)、粗蛋白(Crude Protein，CP)、粗脂肪(Ether Extract，crude fat，EE)等易利用成分快速流失，木质纤维化程度不断加深，不利于发酵微生物的分解转化，给后续的资源化利用造成不利影响，导致原料利用率低、产气效率低下等一系列问题的出现[11-13]；但是同时又有多项研究指出，若以含水率过高、易降解成分含量丰富的生物质材料直接进行厌氧沼气发酵，则易因原料分解过快而引起多种有机酸的超量累积，过多的有机酸不能被产甲烷微生物及时利用，体系pH值急剧降低，出现所谓“过酸化”现象，阻碍厌氧发酵的正常进行，甚至可能直接导致体系崩溃、产气失败[14-15]。因此，了解风干过程对厌氧沼气发酵效率的影响，寻找最佳风干程度，对于提高马铃薯茎叶利用率、避免发酵中的“过酸化”现象、提高产沼气效率十分重要。本研究选取新收割的马铃薯茎叶并在自然条件下风干一定时间，期间监测WSC，CP，中性洗涤纤维(Neutral Detergent Fiber，NDF，包括半纤维素、纤维素、木质素和灰分)等的变化情况；并选取不同风干时间的马铃薯茎叶分别进行单物料中温厌氧发酵，通过日产气量、累积产气量、甲烷含量、pH值等关键指标的比较，探索风干程度对产沼气效率的影响，为马铃薯茎叶这种重要生物质资源的资源化利用提供一定技术指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料：

马铃薯茎叶取自山东省滕州市马铃薯产地，收取时间为6月份马铃薯采收期，分别自然风干不同时间后备用；接种物为取自养猪场厌氧沼气发酵设施的沼渣沼液混合物，4℃冷藏保存备用，使用前35℃复苏2 d；厌氧发酵物料的总固体(Total Solid，TS)、挥发性固体(Volatile Solid，VS)、总碳(Total Carbon，TC)、全氮(Total Nitrogen，TN)、碳氮比(C/N)、可溶性碳水化合物(WSC)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)含量等理化性质见表1。

表1 厌氧发酵物料的基本特性

1.2 厌氧发酵装置

实验采用批式发酵。厌氧发酵装置为发酵瓶、连接管和气体采样袋组成的发酵系统，即以2.5 L容积的玻璃瓶(具橡胶塞)作为发酵瓶，塞子上打孔并以玻璃弯管、橡胶管分别连接铝箔气体采样袋(普莱特，大连)以收集发酵产生的气体；物料装载完毕后，将各发酵瓶连同气体采样袋放于35℃恒温箱中培养；实验周期内，每天手工振荡玻璃瓶2次，以确保物料混合均匀和防止发酵液分层结壳。

1.3 实验方案

1.3.1 马铃薯茎叶风干实验

马铃薯茎叶收取后，平铺于野外避雨通风处自然风干(温度25℃～35℃)，分别风干0 h，12 h，24 h，36 h，48 h，60 h，72 h，84 h，96 h后取回，粉碎至5～10 mm片段后混合均匀，抽真空后置于4℃冰箱存放备用，分别测定样品WSC，CP，NDF等含量等指标。实验结果为3组平行实验的算数平均值。

1.3.2 厌氧沼气发酵实验

共设置6组实验处理，分别为新鲜茎叶组、风干24 h组、风干48 h组、风干72 h组、风干96 h组和接种物对照组，分别记为T1，T2，T3，T4，T5，T0，每组处理均设置3个平行实验。除T0外，各处理组初始TS均设置为5%(以马铃薯茎叶计)，接种物加入量均为500 g，加水补充至2000 mL；T0只含500 g接种物，1500 mL无菌水，各组物料组成详见表2所示。物料混合均匀后一次性加入发酵瓶，以N2向瓶内顶部空间吹入2min并迅速盖紧橡胶塞，以尽量排出空气制造缺氧环境。实验采用35℃中温发酵，实验周期为40 d，实验期间内每天定时收集气体采样袋以测量产沼气量及甲烷浓度，每隔3 d在密封状态下取发酵液测定pH值。

表2 厌氧发酵物料的组成 (g)

1.4 测定指标与方法

1.4.1 秸秆木质化

采用FOSS Fibertec 2010全自动纤维分析仪(FOSS，瑞典)，参照范氏(Van Soest)洗涤纤维法测定马铃薯茎叶的中性洗涤纤维(NDF)含量[16]。

1.4.2 沼气产量

采用湿式气体流量计(TG1，Ritter，德国)测定沼气产量。

1.4.3 沼气成分

采用气相色谱仪(GC1100，普析，北京)测定CH4的百分含量，色谱方法为：载气使用高纯H2；热导检测器(TCD 检测器)；设置进样口和检测器温度分别为110℃和150℃；色谱柱采用填充色谱柱(TDX-01，岛津，日本)，柱箱程序升温，初始温度为40℃，保持2 min后以10℃·min-1速度升温至80℃并保持1min。

1.4.4 其他指标

TS，VS，pH值均按照《水和废水监测分析方法》所述方法进行测定[17]；WSC测定采用硫酸-蒽酮比色法[18]；CP采用凯氏定氮仪测定(Kjel master K-375，BUCHI，瑞士)；EE采用乙醚索氏抽提法测定[19]；TC和TN采用总有机碳/有机氮分析仪(multi C/N TOC，耶拿，德国)测定。

2 结果与分析

2.1 风干时间对马铃薯茎叶成分的影响

风干时间对马铃薯茎叶成分的影响如表3所示。马铃薯块茎收获时，植株发黄凋萎现象并不严重，其茎叶部分的含水量仍然较高，本研究所使用新鲜马铃薯茎叶的初始干物质含量为13.58%，与杨永在、韦国杰、杨闻文等的研究结果接近[5，20-21]。随风干时间的延长，马铃薯茎叶含水率逐渐降低，干物质含量逐渐升高，风干96 h时干物质含量达到44.06%。风干前期马铃薯茎叶失水速度较快，而后期则逐渐减慢，这可能是由于风干前期马铃薯茎叶细胞呼吸作用、蒸腾作用等生理活动仍然旺盛，此时主要失去的是大量细胞游离水；而风干后期细胞逐渐失活，细胞结构水逐渐流失。

表3 马铃薯茎叶成分随风干时间的变化

新鲜马铃薯茎叶含有丰富的可溶性碳水化合物(WSC)、粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)等营养成分，本研究中新鲜马铃薯茎叶中WSC，CP，EE初始含量分别为5.16%，18.20%和4.25%，相较于厌氧沼气发酵中常用的玉米秸秆，马铃薯茎叶CP含量显著较高，WSC则显著较低，EE含量则较为接近[22-24]。随自然风干的进行，马铃薯茎叶WSC，CP，EE含量均有一定程度降低，风干96 h时分别降至3.95%，14.37%和3.04%，降低幅度分别达23.45%，21.04%和28.47%。同失水情况相类似的是，整个风干过程中WSC，CP，EE的减少速度逐渐放缓，这与植物细胞各种代谢活动逐渐减弱存在直接的联系[25]，同时由于水活度的降低，植株表面的土著微生物也更加难以生存。

NDF为植株中半纤维素、纤维素、木质素和灰分等难降解细胞结构组分的总和，较难被植物细胞自身和环境微生物分解，可在一定程度上代表植株的木质纤维化程度。自然风干过程中，在水分逐渐丧失，WSC，CP，EE等易分解有机物含量逐渐降低的同时，马铃薯茎叶中NDF含量却有所增加。实验中，风干96 h时NDF含量达到47.08%，比新鲜马铃薯茎叶高8.55%，这一方面是由于WSC等易分解有机物含量的降低而使得NDF含量相对升高；另一方面，随着时间的延长，木质纤维聚合度、结晶度逐渐提高，纤维素、半纤维素、木质素分子交联更加紧密，也更难以被微生物所利用[26]。探索合适的风干时间，对于马铃薯茎叶的资源化利用是十分必要的。

2.2 厌氧发酵日产气量

对厌氧发酵过程中日产气量的变化进行了统计，结果如图1所示。除只含有接种物的对照组T0外，实验周期内各处理组均出现多个产气高峰，且在实验开始后第1天即迅速出现显著的“产气高峰”，产气量分别达1.45 L·d-1，1.32 L·d-1，1.24 L·d-1，1.30 L·d-1和1.15 L·d-1，均为各处理组日产气量最高峰。实验开始时气体的大量产生主要由马铃薯茎叶自身细胞生理活动、微生物分解代谢、蛋白酶活性作用等因素造成[27-28]，结合图3可以发现，此时产生的气体中甲烷含量很低，且在第1天后各组产气量均迅速降低，说明发酵体系尚未进入厌氧发酵的产甲烷阶段，此“产气高峰”并非真正的沼气产生高峰。

真正沼气产生高峰出现时，甲烷达到较高浓度。从图1可以发现，第1产气高峰出现时间随马铃薯茎叶风干程度加深而逐渐推迟：T1组(新鲜马铃薯茎叶)第1产气高峰出现时间最早，第6天时沼气日产量达1.17 L·d-1；T2组(风干24 h马铃薯茎叶)第1产气高峰出现在第10天，达1.02 L·d-1；T3组(风干48 h马铃薯茎叶)第1产气高峰出现在第13天，达1.04 L·d-1；T4组(风干72 h马铃薯茎叶)第1产气高峰出现在第14天，为0.86 L·d-1；T5组(风干96 h马铃薯茎叶)第1产气高峰出现时间最晚，第15天时沼气日产量为0.86 L·d-1。植物材料风干程度越高，WSC，CP，EE等易被发酵微生物快速利用的成分损耗越多，NDF含量增加，同时植物材料含有的土著微生物数量也因水活度的降低而减少，一般而言原料木质化程度越深，则厌氧发酵启动越缓慢[29-31]。

图1 厌氧发酵日产气量

各处理组在第1产气高峰出现后，随发酵时间延续均又出现1～2个次产气高峰。T1，T2，T3，T4和T5处理组分别在第23、27、28、32天和31天出现5次产气高峰，5次产气高峰产气量分别为0.58 L·d-1，0.79 L·d-1，0.89 L·d-1，0.66 L·d-1和0.56 L·d-1。可以发现除T4组外，随原料风干程度的加深，各处理组次产气高峰出现时间依次延后，与第1产气高峰的出现顺序基本一致。多项研究指出，秸秆类植物原料厌氧发酵时会出现不止一个产气高峰，本研究结果符合这一规律[29-30]。每次产气高峰的产生往往是由于发酵原料中半纤维素、纤维素等难降解成分经多种微生物的复杂生理代谢，逐渐被分解利用的缘故。发酵原料风干程度越高则木质纤维化程度越高、微观结构越紧密，微生物菌群启动发酵所需时间越长，而每次产气高峰出现时间则越晚。值得注意的是相对于其它各组，T2组和T3组每次次产气高峰维持时间较长，表现为一个高产气“平台期”，能够产生更多的甲烷，这可能与T2组和T3组发酵体系pH值、挥发性脂肪酸、微生物菌群等关键发酵指标达到了较好的平衡有关。

2.3 厌氧发酵累积产气量和TS产气率

以不同风干时间的马铃薯茎叶为原料进行厌氧发酵时，各处理组累积产气量的变化如图2所示。在40 d的实验周期内，T1，T2，T3，T4和T5组累积产气量分别为：20.21 L，23.67 L，26.05 L，16.29 L和12.93 L，其中原料风干时间48 h的T3组最高，原料风干时间96 h的T5组最低，T3组累积产气量为T5组的2.01倍。虽然在整个实验周期内，原料风干时间与厌氧发酵累积产气量之间不存在简单的线性关系，但是在厌氧发酵的前中期(前23 d)，却可发现原料风干时间越短则累积产气量越高的现象。由于发酵前中期沼气主要由原料中WSC，CP，EE等易利用组分发酵产生，风干时间越短则这些易利用组分保留越多，因而产气量越高，这也与各处理组第1产气高峰的出现顺序基本吻合；而在发酵的中后期(23 d后)，随着原料中易利用组分的耗尽，沼气微生物菌群主要依靠较难分解的半纤维素、纤维素等产生沼气，此时原料风干时间分别为24 h和48 h的T2，T3组产气量逐渐后来居上，累积产气量明显高于其它各组。该现象说明发酵中后期沼气的产生受多种因素影响，并不完全取决于原料的木质化程度，还与发酵环境酸碱平衡、挥发性脂肪酸浓度、微生物群落构成等多种因素有关。TS产气率可以反映不同物料在发酵周期内的沼气转化效率，一般TS产气率越高，则代表物料产气潜力越大。综合来看，本研究中扣除只含接种物的对照组T0产气量后，T1，T2，T3，T4和T5各组TS产气率分别为193.30 mL·g-1，227.90 mL·g-1，251.70 mL·g-1，154.10 mL·g-1和120.50 mL·g-1，其中以风干48 h马铃薯茎叶为原料的T3组TS产气率最高，产气效果较好。对马铃薯茎叶进行48 h左右的自然风干、降低含水率，虽然WSC，CP，EE等含量相对新鲜茎叶有所下降，木质化程度有一定提高，但是用于厌氧沼气发酵却可以取得较优的产气效果。

图2 厌氧发酵累积产气量

2.4 厌氧发酵过程甲烷含量变化

如图3所示，实验开始一段时间内，各处理组甲烷含量均能提升到50%(体积分数)以上，在实验中后期略有下降但仍基本保持稳定，T1，T2，T3，T4和T5组甲烷含量达到或超过50%所需时间分别为：7 d，8 d，9 d，10 d和11 d，可见马铃薯茎叶风干时间越长则厌氧发酵甲烷浓度提升越缓慢，但是各组彼此差异并不明显；同时，实验条件下各处理组所能达到的最高甲烷含量较为接近，T1，T2，T3，T4和T5组最高甲烷含量分别为：55.05%，54.68%，54.62%，53.55%和53.60%，说明原料风干程度的差异对沼气的最高甲烷含量影响不大。另外，在40 d的厌氧发酵周期内，尽管各处理组产气量和产气效率存在较大差异，但均能达到较高的甲烷浓度并保持相对稳定，可认为实验条件下各处理组均能成功发酵产气，即新鲜和风干24 h,48 h,72 h,96 h的马铃薯茎叶均可用于厌氧发酵沼气生产之中。

图3 厌氧发酵甲烷含量变化

2.5 厌氧发酵过程pH值变化

按照经典的厌氧沼气发酵三阶段理论，物料的厌氧消化主要分为“水解液化”、“产酸”和“产甲烷”3个阶段，即多糖、蛋白质大分子有机物在复杂微生物菌群的作用下，首先分解为单糖、氨基酸等小分子有机物，随后转变为丙酸、丁酸等多种有机酸和CO2，最后生成CH4。3个阶段紧密衔接，每个阶段各有发酵细菌、产酸细菌、产甲烷菌等不同种类的微生物发挥关键性作用[32-33]。不同种类的微生物生存生长所需的最适环境pH值是不同的，但总体而言偏近于中性，WuQ L[34]等认为pH值低于5.0时产甲烷菌活性会受到完全的抑制，因此确保发酵体系酸碱平衡是保证正常产气的必要条件。本研究每隔3 d对发酵过程中各组pH值变化进行了测定，结果如图4所示。整体来看，除T0对照组外，各处理组pH值均呈“迅速降低-升高-小幅降低-升高-稳定”的“W”型变化趋势。在实验开始的3～6 d，T1，T2，T3，T4和T5组均达到发酵过程的最低pH值，各组最低pH值随原料风干程度增加而逐渐升高，分别为5.92，6.05，6.12，6.24和6.48，这与原料风干程度越高，则WSC，CP等易利用组分含量降低，而木质纤维化程度升高有关。有文献报道，以蔬菜废弃物、餐厨垃圾等易腐败原料进行厌氧发酵时，可能由于糖类、蛋白质等易利用组分被微生物过快水解而生成大量有机酸，pH值迅速下降，超出发酵体系缓冲范围和产甲烷菌利用有机酸能力而出现“过酸化”现象，毒害整个沼气发酵微生物菌群而导致发酵产气失败[35-36]。虽然实验开始阶段各组pH值降低幅度较大，但结合日产气曲线(见图1)来看各组均开始正常产气，未出现“过酸化”现象，说明此时的pH值仍在发酵体系的缓冲范围和产甲烷菌等功能微生物耐受范围之内。

图4 厌氧发酵过程中pH值的变化

3 讨论与结论

利用马铃薯茎叶等生物质资源厌氧发酵生产沼气，是实现农业废弃物资源化利用的重要方式。但新鲜茎叶含水量高、易腐败变质，干秸秆则木质化程度太深、可生化性较差，为解决该问题，笔者研究了自然风干对马铃薯茎叶营养成分和厌氧发酵产沼气性能的影响。

厌氧沼气发酵是一个微生物主导的复杂生化过程，其中底物的可生化性直接关系着产气性能的高低。经分析测定，本研究中新鲜马铃薯茎叶中可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪和中性洗涤纤维的含量分别为5.16%，18.20%，4.25%和43.37%，其中可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪属于易利用组分，在发酵中优先被微生物分解利用；而中性洗涤纤维涵盖了纤维素、半纤维素等难降解成分，属难利用组分，一般在易利用组分耗尽后才逐渐得到分解利用。随风干时间的延长，由于植物细胞本身的生理代谢、老化死亡等因素，茎叶水分逐渐流失，可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪等逐渐减少，而中性洗涤纤维含量逐渐升高，即整体呈现易利用组分减少而难利用组分升高的现象。显然，沼气发酵微生物对易利用组分的利用顺序优于难利用组分，该现象类似于微生物发酵中广泛存在的葡萄糖对乳糖、乙醇等其它底物抑制的“葡萄糖效应”[38]。风干时间通过影响易利用组分、难利用组分的含量，间接影响了厌氧发酵产沼气的启动速度，本研究中，新鲜茎叶，风干24 h，48 h，72 h和96 h的马铃薯茎叶处理组到达第1产气高峰的时间分别为第6、10、13、14天和15天，符合“易利用组分含量越高，则厌氧发酵产沼气启动速度越快”的规律。

但是，决定物料厌氧发酵产沼气性能的因素是多方面的，发酵启动速度只是其中之一。相对而言，累积产气量和TS产气率分别可以反映不同物料在发酵周期内的总产气量和沼气转化效率，也是十分重要的指标。由于多数沼气微生物生存的最适pH值接近于中性，健康的发酵体系应是酸碱平衡的体系，而底物中若易利用组分过多，分解过快，导致挥发性脂肪酸等有机酸积累太多，虽然不一定达到“过酸化”的程度，但是也会一定程度上抑制多种功能微生物，特别是产甲烷菌的活性。本研究中，可以发现，以风干48 h马铃薯茎叶为原料的T3组TS产气率最高，为251.70 mL·g-1，高于新鲜茎叶组30.21%，是实验设置条件下的最优产气组。结合发酵过程中pH值的变化(见图4)可以发现，以新鲜茎叶为原料时，体系所达到的最低pH值为5.92，最终pH值为7.70；而以风干48 h马铃薯茎叶为原料时，体系所达到的最低pH值为6.12，最终pH值为8.08，均高于新鲜茎叶组，较为平稳的酸碱环境可能对发酵微生物菌群冲击较小。此外，随着发酵过程的进行，更多的木质纤维素等难利用组分逐渐被转化利用，表现为多个产气高峰的出现，这也是适当风干后的马铃薯茎叶产沼气性能优于新鲜马铃薯茎叶的原因之一。良好的酸碱平衡、挥发性脂肪酸等重要中间产物的稳定产生和消耗、及发酵微生物菌群的平稳演化，都是保障系统较高产气性能的重要条件。后续可以通过菌群高容量DNA测序、实时荧光活性分析等手段对发酵过程中各功能微生物菌群数量和活性变化等进行检测。

本研究的具体结论如下：

(1)风干时间长短对马铃薯茎叶成分有显著影响：风干时间越久，则可溶性碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪等易利用组分含量越低，中性洗涤纤维等难利用组分含量越高。

(2)风干时间显著影响马铃薯茎叶厌氧发酵启动速度，风干时间越久则启动越慢；实验中可能出现多个产气高峰，这与微生物对原料中不同组分利用的难易程度有关；风干时间对产气甲烷浓度影响不大，各处理组甲烷浓度均可达50%以上并保持相对稳定；累积TS产气率并不完全取决于风干程度，各处理累积TS产气率由高到低依次为：48 h风干茎叶、24 h风干茎叶、新鲜茎叶、72 h风干茎叶和96 h风干茎叶。

(3)马铃薯茎叶可作为合适的厌氧发酵原料，在35℃中温条件下进行40 d的批式厌氧发酵，累积TS产气率最高可达251.70 mL·g-1。鉴于风干时间对马铃薯茎叶产沼气效率的重要影响，实践中可选择对原料进行48 h左右的自然风干，降低含水率，既方便贮存、避免腐败变质，又可一定程度上增加沼气产量，提高原料利用率。