人乳头瘤病毒E6/E7基因在宫颈癌发展过程中作用机制的研究

李明秀　刘志强　许振　杨世慧

[摘要]目前，宫颈癌仍是全球范围内女性最常见的生殖系统恶性肿瘤，其中90%宫颈癌患者伴有人乳头瘤病毒（HPV）的感染，以高危型HPV 16和18型为主。高危型HPV E6/E7基因是造成细胞永生化和肿瘤进展的主要原因，病毒基因组整合到宿主基因组是癌基因E6和E7致癌的关键步骤，大量研究证实E6和E7基因可以导致p53和pRb两个重要的抑癌基因失活，而最新的研究表明这两种基因可以作用于更多的细胞因子，如细胞的甲基化状态、PI3K-AKT通路、基质金属蛋白酶（MMPs）、白细胞介素-18（IL-18）等，对这些因子的不同影响最终导致了癌症的发生、转移及免疫逃逸等。

[关键词]E6/E7;人乳头瘤病毒;宫颈癌;PI3K-AKT;甲基化;基质金属蛋白酶;免疫机制

[中图分类号] R711          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）6（a）-0023-05

[Abstract] At present， cervical cancer is still the most common reproductive system malignant tumor in women worldwide， and 90% of patients with cervical cancer are infected with Human papillomavirus （HPV）， among which high-risk HPV types 16 and 18 are the main types. High-risk HPV E6/E7 gene is the main cause of cell immortalization and tumor progression. The integration of the viral genome into the host genome is a key step for oncogenes E6 and E7. A large number of studies have confirmed that E6 and E7 genes can lead to the inactivation of two important tumor suppressor genes， like p53 and pRb， the latest researches have shown these two genes can act on more cytokines， such as cell methylation status， PI3K AKT pathway， matrix metalloproteinases （MMPs）， and interleukin-18 （IL-18）， and different effect on these factors ultimately lead to the occurrence， metastasis and immune escape of cancer.

[Key words] E6/E7; Human papillomavirus; Cervical cancer; PI3K-AKT; Methylation; Matrix metalloproteinase; Immune mechanism

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一种属双链闭环的球形小DNA病毒，在恶性肿瘤中，HR-HPV DNA首先与宿主细胞内的染色体整合，然后表达病毒E6、E7癌基因转录形成E6/E7 mRNA，进一步翻译形成E6、E7蛋白，E6和E7蛋白可以降解pRb蛋白使宿主细胞进入S期，使病毒不断复制，同时E6蛋白可以降解p53蛋白，逃避凋亡，使细胞分裂不受控制，导致基因组不稳定的发生，这为肿瘤的发生提供了前提条件，其表达水平与宫颈病变的进展程度及细胞的恶性转化关系十分密切。本文主要从以下4个方面介绍HPV E6/E7基因在宫颈癌发展过程中的作用机制。

1 E6/E7蛋白调节甲基化状态

癌症是由许多因素引起的疾病，近期研究发现表观遗传学是其中一个主要因素，通过改变细胞微环境在癌症发展中起重要作用。DNA甲基化是用于修饰基因功能的表观遗传机制之一，不改变细胞的核苷酸序列[1]。研究表明，HPV感染细胞与细胞基因启动子高甲基化密切相关，并抑制其转录[2-3]。在感染HPV的细胞中观察到位点特异性甲基化的现象，其中87%的位点位于甲基化可变位置（MVP）的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CPG），该位点显示病毒阳性的细胞甲基化增加。有研究者用人角质形成细胞转染E6/E7基因后进行甲基化特异性检测，其数字核型分析显示，有34个基因显示甲基化增加，同时基因表达下降[4]，这进一步验证了E6/E7蛋白可调节细胞甲基化状态，干预细胞基因正常转录。其中，E-钙粘蛋白参与上皮中病毒的检测，是HPV功能上重要的甲基化靶点，它与其他刺激信号协调朗格汉斯细胞通过上皮细胞的运动，从而增强宿主免疫系统的刺激来清除生物体中的病毒。在HPV感染的细胞中，E-钙粘蛋白表达较低减少了朗格汉斯细胞的迁移，从而降低了上皮细胞的病毒清除率。然而，E6和E7都能通过DNA甲基转移酶1（DNMT1）的活动下调E-钙粘蛋白，而且E6的过度表达可导致E-钙粘蛋白表达降低以及DNMT活性增加。相关研究表明，在高危型HPV感染细胞中，E6癌蛋白主要通过降解p53来增加DNMT1的表达和活性。E7调控DNMT1的过程分为两种途径，在间接机制中，E7与pRb结合并释放一种存在于DNMT1的转录起始位点的转录因子，从而激活DNMT1的启动子;在直接机制中，E7直接与DNMT1结合，导致DNMT1的构象变化，并暴露活性位点，使E7/DNMT1与DNA的结合，在E7与复合物解离后形成稳定的DNMT1/DNA复合物，由于肿瘤抑制基因的沉默，这导致基因组的甲基化，并导致宫颈癌的发生[5]。另外，E7和DNMT1对细胞周期调节蛋白A1即细胞周期素A1（CCNA1）基因的启动子有直接作用，这种相互作用已经在体外通过芯片实验得到了验证，实验结果显示，E7和DNMT1均位于CCNA1启动子上，导致CCNA1的表达受到抑制[6]。通过这个发现，有研究提出利用CCNA1的甲基化状态作为一个潜在的区分正常宫颈、低级别和高级别鳞状上皮内病变的生物标志物[7]。趋化因子CXCL14也被鉴定为E7的甲基化靶点，其参与调控体内许多生物学过程，如炎症反应、肿瘤的血管生成、肿瘤的特异性免疫激活以及肿瘤的自分泌调节等，E7蛋白作用于CXCL14的启动子并形成高甲基化状态，导致其抑制肿瘤血管生成的功能失活，进一步促进肿瘤的生长[3]。总之，E6/E7蛋白通过诱导DNMT的表达，导致异常的DNA甲基化和正常表观遗传过程的破坏，进而使调节细胞周期、参与细胞凋亡和粘附的基因表达水平发生改变，最终走向肿瘤的结局[6]。

2激活磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路

近年来，PI3K-AKT途径已被多次证明其在恶性肿瘤的发生发展中起着关键作用，尤其是与HPV相关的癌症，该通路通过改变其靶基因的表达来实现多种细胞和分子功能，包括细胞生长和增殖、代谢、凋亡、迁移、侵蚀及血管生成等[8]，这些调节关系到肿瘤的发生、发展和结局，因此这条道路已被提议作为许多癌症（包括宫颈癌）有希望的治疗靶标。其中，PI3K通过调节不同的信号通路，促进细胞增殖、存活，防止细胞凋亡，是肿瘤发展的加速剂[9]。而AKT的磷酸化通过刺激AKT的催化活性，导致靶基因的磷酸化，产生一系列的生物学行为，如细胞的增殖、动员、存活以及血管的生成和抗凋亡能力，最终导致肿瘤进一步发展与转移，甚至产生耐药性[10]，影响患者预后。研究表明，E6/E7蛋白可通过多种细胞及分子事件激活PI3K-AKT通路，从而导致癌症的发生[11]。E6蛋白还可通过上调PI3K激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以促进细胞的增殖，且PI3K的活性在MAPK通路的不同水平都发挥着重要的诱导作用，E6蛋白通过PI3K间接作用于MAPK通路来调节细胞活动。研究发现[12]，钠氢交换调节因子1（NHERF-1）是一种分子途径组织者，其在细胞过程中发挥着信号转导、细胞转化和细胞募集，细胞质和细胞骨架信号蛋白转化为功能复合物等作用。E6蛋白主要通过降解NHERF-1、激活PI3K-AKT通路这两种重要途径在肿瘤形成的过程中发挥作用，而E7蛋白可以激活细胞周期蛋白依赖性激酶复合物进一步促进E6蛋白对NHERF-1的降解。研究发现，苏氨酸308位点和丝氨酸473位点的磷酸化是E7蛋白激活AKT的关键位点，随后AKT的激活作用于相关死亡启动因子（BAD）并使其磷酸化，减少了与Bcl-xl和Bcl-2的结合，阻止细胞色素C释放入胞浆，从而抑制细胞凋亡。另外，E7蛋白也可以通过结合和隔离已知的结合配体来维持AKT基因处于活跃状态，从而抑制AKT基因的去磷酸化，活跃的AKT基因激活MDM2癌基因，增加p53降解并导致pRb失活，进一步加强已建立的E6/E7对p53和pRb功能的影响[13-14]。据报道，蛋白磷酸酶2（PP2A）属于丝氨酸苏氨酸磷酸酶，其与P-AKT的35 kDa催化和65 kDa结构亚基相互作用，导致AKT的磷酸化，干扰细胞凋亡过程。此外，HPV E7蛋白与两个PP2A亚基结合，以防止它们与P-AKT相互作用，从而维持AKT通路的激活。E6、E7蛋白通过激活PI3K-AKT通路并使AKT通路处于活跃状态，诱导了细胞的永生化并逃避免疫监视，是致癌的关键通路，而且该研究表明，肿瘤细胞中高表达AKT2能降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，导致肿瘤细胞耐藥[15]。

3上调基质金属蛋白酶（MMPs）促进肿瘤转移

MMPs是锌依赖性蛋白酶家族之一，其通过破坏细胞外基质促进肿瘤细胞的迁移和转移。目前MMPs家族的26个成员中，MMP-2和MMP-9多与患者预后不良相关。肿瘤细胞在致癌基因激活后合成MMP，从而使抑癌蛋白失活，刺激生长因子或炎症介质的生成以及活性氧的产生和/或缺氧的存在，它们作用于细胞表面分子，影响细胞之间或细胞与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）之间的粘附（如钙粘蛋白或整联蛋白），从而使肿瘤细胞与相邻细胞和ECM分离，在肿瘤进展中发挥重要的作用。其次，MMPs降解基底膜和ECM，为癌细胞运动和组织侵袭做准备[16]。而且研究发现MMPs允许癌细胞到达局部血液或淋巴管并穿透其壁，进而导致血行转移及淋巴转移，在小血管腔中，癌细胞通过MMP动作进入血管壁，并且在逃脱免疫监视的情况下，产生继发性肿瘤[17]。有研究发现，MMP成员中的MMP-9，MMP-2和MT1-MMP在宫颈癌的发生发展中扮演着重要的角色，它们的RNA或蛋白质表达在正常子宫颈和低级CIN中极低或不存在，在高级CIN及宫颈癌患者中表达量很高，此外，这些MMP的表达与高级CIN及宫颈癌患者中肿瘤血管密度成正相关[18]。MMPS在宫颈病变过程中离不开E6或E7蛋白的调节，在正常或转化的上皮细胞中，致癌的E6或E7蛋白下调TIMP和/或上调MMP-2，MMP-9或MT1-MMP表达，从而增加上皮细胞的侵袭力，因此，宫颈癌患者血浆中MMP-9、MMP-2或MT1-MMP的含量与预后不良和肿瘤分期较高相关[19]，而这些现象与E6和E7蛋白对丝氨酸/苏氨酸激酶AKT通路的激活有一定的相关性[20]。综上所述，磷酸化的AKT可以促进MMPs基因表达，即E6和E7蛋白激活AKT通路使其磷酸化，又进一步促进了MMPs基因的表达，增加了肿瘤细胞的迁移和转移。

4通过白细胞介素-18（IL-18）逃避免疫监视

IL-18是一种中性粒细胞趋化因子，由单核细胞产生，主要负责调节细胞增生及ECM的生成。细胞免疫是抗肿瘤的主要免疫方式，IL-18通过刺激Thl和Th2细胞增殖，并增强NK细胞和Thl细胞的细胞毒作用，促进T细胞的增殖，因此在抗肿瘤的免疫过程中发挥着重要作用。研究表明，Thl和Th2的比例失衡与肿瘤的发生、转移及复发密切相关[21]。为了进一步证明E6及E7基因对IL-18的作用，Cho等[22]通过细胞转染的方法使HaCAT（正常角质形成细胞系）和C-33A（HPV阴性宫颈癌细胞系）稳定表达E6、E7蛋白，通过RT-PCR检测各细胞系中IL-18的表达，结果显示，E6的表达与IL-18的表达成负相关，同时发现在表达E6基因的C-33A细胞系中p53基因表达显著下降，而E7在两细胞系中均未显著影响IL-18的表达。共转染实验表明，E6癌基因不直接抑制IL-18启动子P1和P2的活性，而是通过间接途径抑制IL-18表达，并抑制IL-18受体活化后的下游联级效应，使机体不能及时通过细胞免疫消灭病变细胞，导致突变细胞的增殖、扩散。另外研究发现，IL-18具有诱导产生干扰素-γ2的功能，干扰素-γ2具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤的特性，当机体持续感染HPV时，E6、E7蛋白通过间接抑制干扰素-γ2的产生来逃避免疫监视，加快肿瘤的形成[23]。

5小結

综上所述，HPV E6/E7可通过多种途径导致宫颈癌，这些途径之间并不是独立的，而是相互作用共同导致了肿瘤的发生发展。近年来，宫颈涂片作为宫颈癌的初步筛查方法，为广大女性赢得了及时诊治的机会，但宫颈细胞学的局限性和较高的假阳性率是开发新预防方法的充分理由[24]，且目前宫颈癌的治疗方式仍以手术治疗为主，术前的新辅助化疗及术后化疗仍不能有效预防宫颈癌的复发及转移[25]。目前，已有大量研究开始从致癌机理上寻找突破口，探索预防和治疗恶性肿瘤的新靶点，如DNA疫苗、基因治疗及创新的RNA干扰技术（RNAi）等。RNAi是通过降解转录后mRNA或抑制其翻译成蛋白质来阻断目的基因的表达，沉默目的基因的表达是目前实验较常用的实验方法，该技术能否为今后的基因靶向治疗提供有效的帮助仍需进一步探索。上文提到，DNA甲基化是癌基因表达最重要的表观遗传机制之一，这些表观遗传修饰涉及肿瘤进展，并且可能在某种程度上可用于未来的诊断[26]。另外，用DNMT抑制剂处理细胞会导致被抑制的基因重新表达并增加细胞对化疗的敏感性，希望通过进一步研究可以将这一机理应用到预防宫颈癌复发与转移的治疗中[27]。近年来，PI3K-AKT抑制剂也成为宫颈癌治疗研究的热点，尤其是HPV感染患者，有研究发现AKT抑制剂在常氧条件下抑制HPV阳性癌细胞的增殖，结果表明，AKT抑制剂的抗增殖作用优于来自E6/E7的促生长刺激作用[28]。另外，PI3K/AKT抑制剂具有免疫调节特性，其可通过降低免疫抑制细胞因子和趋化因子的表达以及抑制免疫调节细胞（如调节性T细胞或髓源抑制因子）的效应功能来增强肿瘤免疫监视[29]。由于HPV阳性癌细胞的恶性生长依赖于病毒癌基因的连续表达，因此要更加深入地研究E6/E7基因的致癌机制，争取找到预防和治疗宫颈癌及其他相关恶性肿瘤的有效靶点。

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（收稿日期：2019-12-16  本文編辑：任秀兰）