木姜子和忍冬藤配伍乙醇提取物减轻哮喘小鼠气道炎症的效果

蓝凰齐 张世田 唐汉庆 黄小珊 李克明 林起庆

(1广西中医药大学基础医学院，广西 南宁 530200；2右江民族医学院)

哮喘是一种变态反应性疾病，气道炎症在哮喘发生发展进程中起着重要作用，哮喘发作期气道高反应性和临床症状表现突出，而在哮喘缓解期，临床症状尽管得到一定程度的控制，但气道炎症如果没有得到有效缓解或治疗，最终会导致气道重塑和不可逆肺功能损害〔1,2〕。哮喘属于疑难杂症，根治的难度较大，民族传统医药中有些疗法和药物对哮喘此类疑难杂症有较好的效果，木姜子和忍冬藤属于壮族医药常用药物，两药相伍民间用于减轻哮喘发作，对于木姜子和忍冬藤配伍用于哮喘治疗，其起效机制是否通过减轻哮喘炎症，抑制炎性细胞在肺组织浸润从而缓解气道平滑肌痉挛，尚未见报道。本研究通过建立哮喘小鼠模型，观察针挑疗法及木姜子和忍冬藤配伍对哮喘小鼠相关炎症因子水平的影响，探讨其起效机制，为针挑疗法及木姜子和忍冬藤配伍的应用及促进其在民族医药领域的进一步交流提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1实验动物 70只健康清洁级昆明种小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18.56～23.22 g。由右江民族医学院动物实验中心提供(许可证编号:SCXK桂2017-0004)。实验遵循动物伦理的有关准则。

1.2药物与试剂

1.2.1药物 木姜子购于广西仁济堂中药饮片公司(批号151101)；忍冬藤购于广西张益堂中药饮片有限公司(批号1602092)；将木姜子和忍冬藤按照1∶1比例，放到适量 70%食用乙醇里浸泡1 w，旋转蒸发仪旋转蒸发，浓缩为浓度 100 mg/ml，灌胃时将浓度稀释为 2 mg/ml。地塞米松购于广东华南药业集团有限公司(批号H44024469)。

1.2.2主要试剂 白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10、免疫球蛋白(Ig)E、干扰素(IFN)-γ酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒及锌指蛋白(GATA)-3蛋白检测试剂盒(伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分别为AK0017DEC27018、AK0017DEC27019、AK00-17DEC27023、AK0017DEC27026、AK0017DEC270-32、UB1702311)；OVA(Solarbio公司，批号1218B-031)；氢氧化铝(Thermo公司，批号SG252318)。

1.3仪器 DU530型紫外分光光度仪(美国Beckman公司)；MK3型酶标仪(美国Thermo Labsystem 公司)；PowerPac HC 型电泳仪、chemidoc XRS型凝胶成像系统(美国伯乐)； 402B型超声雾化器(上海鱼跃医疗设备有限公司)；RM2245型切片机(徕卡显微系统(上海)有限公司)。

1.4动物分组、造模及给药处理 小鼠随机分为空白组、模型组、木姜子和忍冬藤配伍低、中、高剂量组(低、中、高剂量组)、针挑疗法组(针挑组)、地塞米松阳性对照组(阳性组)7组，每组10只。参考文献〔3〕造模方法。除空白组外，其他各组分别在实验第1、8天腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏液0.5 ml/只(含5 mg OVA和15 mg氢氧化铝)。第15天开始，将小鼠放入30 cm×30 cm×30 cm自制透明雾化箱中，每日通过雾化管向箱中喷入1 % OVA 30 min，雾量控制为0.5 ml/min，连续7 d。在雾化激发的同时，将小鼠置于温度为-4～4℃的寒冷环境中，空调冷风吹袭，每日30 min，连续7 d。空白组的致敏液和激发所有试剂以生理盐水代替。造模过程中，进行小鼠行为学观察。造模小鼠在OVA溶液激发后开始表现为烦躁不安，活动频繁，继而呼吸急促，严重者缩胸、伸颈、收腹、大小便失禁，并随着雾化和寒冷刺激天数的增加，小鼠饮食减少、毛色无光泽、行动迟缓及体重逐渐下降，并在喘息表现基础上出现恶寒、扎堆少动，四肢不温，弓背毛耸、喷嚏、流清涕、唇周发白等症状，而治疗干预各组上述症状相对较轻，依据相关文献报道〔4〕，表明造模成功。

自激发第8天起，低、中、高剂量组每天分别给予5、10、20 mg/kg木姜子和忍冬藤的乙醇提取物灌胃，阳性组给予地塞米松10 mg/(kg·d)；空白组和模型组给予等量的生理盐水。针挑组选取定喘、肺俞、大椎、风门、肾俞、脾俞穴位，用三棱针挑出皮下部分纤维组织。每天1次，7 d为1个疗程，治疗1个疗程。疗程结束后取材检测指标。

1.5指标检测

1.5.1炎症因子指标检测 各组小鼠末次激发24 h后，用10%水合氯醛(无菌生理盐水稀释)腹腔注射麻醉，心脏取血，立即注入含有40 μl肝素的抗凝管中，2 000 r/min离心15 min，保存于-80℃冰箱中备测炎症因子IL-4、IL-5、IL-10、IgE、IFN-γ，采用ELISA检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.2GATA-3蛋白检测 取右肺组织，匀浆，提取蛋白，Western印迹检测，按照试剂盒说明书进行操作。将条带截图，用 ImageJ 软件分析条带的灰度值。目的蛋白的灰度值与内参蛋白的灰度值比值即为目的蛋白的相对表达量。

1.5.3肺功能检测 末次治疗干预结束后1 h，10%的水合氯醛麻醉小鼠后，将小鼠仰卧固定于鼠台上，用剪切开颈部皮肤并暴露气管，以第2、3 环状软骨为标志做横行切口，插入胶管行气管插管，用丝线结扎、将小鼠置于肺功能仪体描箱内并连接动物呼吸机实施机械通气。进行第0.1秒用力呼气末容积(FEV0.1)、第0.2秒用力呼气末容积(FEV0.2)、第0.4秒用力呼气末容积占用力肺活量比值(FEV0.4/FVC)、呼气峰流速(PEF)的肺功能指标检测。

1.5.4肺组织形态学观察 切取左肺组织用0.9%氯化钠注射液洗净，10%甲醛固定，常规脱水，制作蜡块，切片后进行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理变化。

1.6统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析及LSD-q检验。

2 结 果

2.1各组炎症因子指标水平比较 和空白组比较，模型组血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平升高而IFN-γ 水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；和模型组比较，针挑组、阳性组和各剂量组血清IgE、IL-4、IL-5、IL-10水平降低而IFN-γ水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表1。

表1 各组IgE、 IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ水平比较

2.2各组肺功能比较 和空白组比较，模型组FEV0.1、FEV0.2、FEV0.4/FVC、PEF的肺功能指标明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。和模型组比较，针挑组、阳性组和各剂量组均能改善肺功能，差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见表2。

2.3GATA-3蛋白表达检测结果 和空白组比较，模型组GATA-3蛋白表达升高；和模型组比较，针挑组、阳性组和各剂量组均能纠正GATA-3蛋白过高表达(P<0.01,P<0.05)。见表2，图1。

表2 各组肺功能及GATA-3蛋白表达比较

M：Marker；1～7：模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性组、针挑组、空白组图1 GATA-3蛋白表达电泳

2.4各组小鼠肺组织形态学观察 空白组支气管、肺组织清晰，管壁光滑，无血管充血及炎症细胞浸润；模型组支气管、肺组织结构不清、管壁不光滑、有大片炎症细胞浸润；针挑组、阳性组和各剂量组肺泡间隔增厚不明显，肺泡渗出物较少，黏膜下及肺间质炎症细胞浸润程度也较轻，较模型组有明显改善。见图2。

图2 各组肺组织形态学(HE,×200)

3 讨 论

哮喘发生发展中的气道高反应性一直受到关注，其机制研究不断深入，炎症反应起到重要作用，气管和肺组织的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润导致黏液分泌和气道高反应性，长期处于此种情况，将会进一步导致气道重塑不可逆性增加，使哮喘的治疗变得更困难，这也是中医学将“喘”列为疑难杂症之一的原因。有医学研究表明，在哮喘中，Th2型细胞炎症因子如IL-4、IL-5、IL-10等存在水平上升而Th1型细胞因子如IFN-γ水平下降的现象〔5〕，其中IL-4作为炎症介质，刺激B细胞分泌IgE，促进嗜酸性粒细胞的增殖和聚集，引起炎症的反应扩大，加重了气道高反应性并促进其进展。促炎因子IL-5或IL-10可刺激嗜酸性粒细胞的分化〔6〕，Th2型细胞炎症因子的优势表达是哮喘发生发展炎症反应持续的重要原因。IFN-γ作为Th1型代表性细胞因子，已有研究表明其在加强机体免疫功能方面的重大作用，而且IFN-γ/IL-4的水平可反映Th1/Th2平衡，提高IFN-γ水平或降低IL-4水平可控制哮喘的炎症反应〔7〕，Th2型细胞炎症因子的优势表达需要转录因子的参与刺激，GATA-3作为Th2型细胞炎症因子分泌的特异性转录因子已得到广泛认同，其高表达刺激Th2型细胞炎症因子的分泌，考虑通过调节转录因子表达从而控制哮喘炎症反应成为一种思路。

壮医针挑疗法是在壮医理论指导下的临床外治技法，是壮族医药的一种特色疗法，一般采用消毒大号缝衣针根据不同疾病选取不同穴位作为挑刺点，挑出皮下一些纤维组织，具有所需器械简单及操作易学的优点，对哮喘有较好的缓解作用，作为一种哮喘治疗和肺康复的物理治疗手段，在哮喘及肺康复具有较好的临床应用价值，近年来受到关注和肯定。壮医药理论一般认为其通过调节“谷道”、“水道”、“气道”、“龙路”、“火路”五条道路(即“三道两路”)起效〔8〕。本研究针挑组选取定喘、肺俞、大椎、风门、肾俞、脾俞穴位，起到疏通气道，同时对“谷道”、“水道”、“龙路”、“火路”也起到良性的刺激作用。木姜子和忍冬藤是常用的壮药，民间传统上将木姜子和忍冬藤等量配伍，再用小锅米酒进行浸泡，当作保健滋补酒适量饮用，对哮喘有一定的缓解作用，相当于民间经验方，在壮族民间用于哮喘的治疗。其中木姜子具有止咳平喘、解痉镇挛、补虚强身作用，现代药理学认为其具有抗炎〔9〕、提高免疫功能作用〔10〕。忍冬藤有清热解毒、疏风通络作用，现代药理学认为其具有抗炎〔11〕、抗氧化〔12〕、提高免疫功能〔13〕、舒张平滑肌作用〔14,15〕。本实验工作采用木姜子和忍冬藤配伍治疗哮喘，通过检测相关炎症因子指标，观察其起效机制，从而为其在中医药(民族医药)领域的交流和应用提供基础研究依据。本研究结果与近来报道〔16〕一致，提示针挑疗法、木姜子和忍冬藤配伍治疗哮喘，能够调节GATA-3表达，通过减轻哮喘炎症，抑制炎性细胞在肺组织的浸润从而改善肺功能而起效，但对于其调节GATA-3表达的更上游机制，仍需要下一步的研究。