牙周状况对主动脉瘤影响的初步探究*

温丹丹 吕亚林 丁 芳 陈珊珊 韩 笑

近年来慢性炎症反应机制对主动脉瘤(Aortic Aneurysm，AA)的影响颇受关注。炎症反应表现为炎症细胞的趋化，其中以巨噬细胞的作用最为突出[1]。巨噬细胞可诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)大量表达，MMPs 参与胶原蛋白和弹力纤维的破坏，最终导致AA 的形成和发展[2]。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是由菌斑微生物所引起的牙齿周围支持组织的慢性感染性疾病，其中革兰阴性菌发挥重要作用。牙周细菌可以通过咀嚼和刷牙从龈沟释放到血液中，菌体及其产物以及大量的炎症介质不断进入血液循环并扩散至其他远隔器官，继而与心血管系统的组织发生相互作用。在心血管疾病如动脉粥样硬化、动脉瘤等病理标本中检测到牙周细菌，提示心血管疾病与牙周炎症密切相关[3,4]。本实验通过对不同牙周状况伴主动脉瘤的患者进行牙周检查及瘤体组织检测分析，初步探究牙周状况对主动脉瘤的影响。

1.材料与方法

1.1 研究对象与实验材料

1.1.1 研究对象 选取2014 年1 月～2018 年6 月在首都医科大学附属北京安贞医院大血管外科住院的主动脉瘤患者74 例，其中男性58 例，女性16 例，年龄54～85 岁，平均(66.9±7.6)岁，所有患者经CT 检查主动脉直径大于正常值50%，并接受主动脉瘤手术。纳入标准如下：

(1)6 个月内无牙周系统治疗史，3 个月内未连续使用抗生素；(2)排除假性动脉瘤，动脉夹层；(3)无系统性疾病，如恶性肿瘤、糖尿病、肝炎、呼吸及血液系统疾病；(4)女性不在月经期、妊娠期或哺乳期；(5)无其他慢性感染性疾病。

所有患者临床试验前均签署知情同意书。本研究开始前获得首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会的批准(伦理编号：2012001X 和2015011X)。

1.1.2 器材及试剂 组化笔(GT1001，Gene tech，中国)，病理切片机(RM2016，上海徕卡仪器有限公司，中国)，显微镜(XSP-C204，CIC，中国)。CD68 一抗(66231-1-Ig，proteintech，中国)，MCP-1 一 抗(Ab9669，Abcam，中 国)，TLR4 一抗(Ab22048，Abcam，中国)，ICAM-1一抗(60299-1-Ig，proteintech，中国)，山羊抗兔鼠通用二抗(K5007，DAKO，中国)，组化试剂盒DAB 显色剂(G1211，Servicebio，中国)。

1.2 研究内容 对所有研究对象在术前进行牙周临床检查及分组，并行问卷调查，在术中采集瘤体组织标本福尔马林固定，后行HE 染色及CD68、ICAM-1、TLR-4、MCP-1 的免疫组织化学染色。

1.2.1 牙周临床检查及分组

(1)牙周临床检查：检查并记录每位受检者全口牙周状况，记录每颗牙6 个位点：颊侧近中、中央、远中及舌侧近中、中央、远中的牙周探诊深度(Probing depth,PD)和附着丧失(Attachment Loss,AL)，同时记录全口缺失牙数(不包括4 颗第三磨牙)情况。拍摄全口曲面断层片，以显示全口牙齿的牙槽骨吸收程度和类型。所有受检者的牙周检查均由同一位经验丰富的牙周专科医师完成。

(2)研究对象分组：根据牙周检查情况将研究对象分为2 组，即：

A 组：牙龈炎及轻度牙周炎伴主动脉瘤组：患主动脉瘤且伴有牙龈炎或轻度牙周炎者。

牙周健康或牙龈炎：平均附着丧失(attachment loss，AL)≤0.5mm、邻面AL≥3mm 的位点数为0，失牙数(除第三磨牙或正畸需要的拔牙、外伤或重度龋失牙及先天性缺牙外的失牙)不超过2 颗[5]。

轻度牙周炎即牙周袋深度≤4mm，附着丧失1～2mm，x 线片显示牙槽骨吸收不超过根长的1/3。

B 组：中、重度牙周炎伴主动脉瘤组：患主动脉瘤，具有中、重度牙周炎者。

中、重度牙周炎指口内余留牙＞16 颗，PD≥4mm、CAL≥3mm，牙槽骨吸收达牙根长30%以上的牙齿≥全口牙数的30%，且至少有2 颗牙的PD≥5mm，CAL≥3mm，分布于2 个不同象限。

1.2.2 问卷调查 所有受试者在动脉瘤手术前均接受详细的问卷调查，内容包括个人一般情况如年龄、性别、体重、吸烟、饮酒情况等。

1.2.3 瘤体组织采集、处理及检测 所有受试者术中动脉瘤瘤体组织离体后立即放入无菌病理袋内，福尔马林固定，常规石蜡包埋切片，脱蜡至水，行HE 染色及CD68、ICAM-1、TLR-4、MCP-1 的免疫组织化学染色(按试剂盒说明书操作)，后于光学显微镜下观察，用Image Pro Plus 6.0 软件分析瘤体组织中各因子的表达情况。所有处理及检测均于首都医科大学附属北京安贞医院心肺研究所完成。

1.3 统计学分析 应用SPSS22.0 统计软件，计量资料以表示，符合正态分布的两组间比较采用独立样本t 检验，不符合正态分布则用Mann-Whitney U 非参数检验；计量资料用Pearson 卡方检验和Fisher 精确检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 牙周状况及分组情况 74 例主动脉瘤患者中无牙周健康患者，其中患有牙龈炎及轻度牙周炎患者20 例，即为A 组；患中、重度牙周炎患者54 例，即为B 组。各组牙周探诊深度、附着丧失、影像学骨丧失量及缺牙数情况如下表(表1)，两组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组临床牙周检测及分组情况

2.2 一般资料比较 一般情况资料分析显示：年龄、性别、体质指数、吸烟和饮酒比例在A、B两组间的差异均无统计学意义(P＞0.05)(表2)。

表2 各组一般情况临床资料比较

2.3 病理学分析

2.3.1 HE 染色 HE 染色结果表明，B 组较A 的动脉壁结构不规则，多数伴有炎症细胞浸润，平滑肌细胞走形紊乱且部分溶解消失，弹性纤维层明显变薄并走形不规则。

图1 各组主动脉瘤患者瘤体组织HE 染色(×40)

2.3.2 免疫组织化学检测 免疫组织化学染色结果表明，在动脉瘤的外膜和中膜中可见炎性细胞浸润(图2)，B 组中CD68 标记的巨噬细胞数、ICAM-1 表达量及TLR4 阳性染色细胞数均高于A 组(P＜0.05)，而MCP-1 在两组瘤体组织中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。(图2，3，表3)

图2 各组主动脉瘤患者瘤体免疫组织化学染色(×200)

图3 各组主动脉瘤患者瘤体免疫组织化学染色表达比较

表3 腹动脉瘤组织中CD68、ICAM-1、MCP-1、TLR-4 的表达

3.讨论

慢性炎症细胞浸润是AA 病变的典型特征，由病原微生物引起的感染性炎症可起到促进AA 发展的作用。牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周组织的感染性疾病，许多流行病学研究指出牙周致病菌参与全身性疾病的发展，其中心血管疾病被认为是与牙周细菌感染密切相关的疾病[6]。Lockhart 提出了支持牙周疾病和心血管疾病相关的科学论点[7]。相关研究发现牙周病是外周血管疾病的重要独立危险因素[8]，Meta 分析显示在调整了其他危险因素如吸烟、糖尿病、饮酒、肥胖和高血压因素之后，牙周炎是冠心病的独立危险因素[9]。本研究对74 例不同牙周状况的主动脉瘤患者进行年龄、性别、体质指数、吸烟和饮酒的一般临床资料调查，发现以上因素比较并无统计学意义(P＜0.05)，在探究中重度牙周炎与AA 间的关系时排除了上述因素对于实验结果的影响。

牙周炎患者体内与血管内皮功能障碍和心血管事件相关的炎症标志物如C 反应蛋白，肿瘤坏死因子-α，白细胞介素(interleukin，IL)等水平升高[10]。Dietrich T 等研究得出：与未患牙周炎患者相比，牙周状况较差的牙周炎患者冠状动脉疾病发生率更高，这种影响独立于其他已确定的心血管危险因素[11]。Beck 等研究中也发现，牙周袋深度、牙槽骨丧失量与冠心病和脑出血密切相关[12]。课题组前期研究发现，在排除年龄、性别、吸烟及高血压、糖尿病等影响因素后发现：AA 患者较非主动脉瘤患者牙周炎患病率更高，牙周状况更差；且在伴牙周炎的AA 患者的瘤体组织中可检测到相应的牙周致病菌[13,14]。本研究HE 染色结果表明牙周炎症越重AA 动脉壁结构越不规则，炎细胞浸润越明显，动脉壁破坏越严重，进一步验证了牙周炎与AA 间的关系。

相关研究也发现，口腔细菌在AA 的发生发展中也起到一定促进作用，巨噬细胞在AA 病变的炎症浸润中至关重要，而CD68 通常高表达于巨噬细胞。不同的牙周致病菌会诱导内皮细胞产生不同的炎症反应，P.g 有较强的诱导内皮细胞产生单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的能力[15]。Koizumi 等也发现P.g 诱导内皮细胞表达ICAM-1 的能力强于其他牙周致病菌[16]，从而增加内皮细胞的通透性，促进炎症细胞的趋化。此外Toll 样受体与牙周炎密切相关[17]，Toll 样受体-4(toll-like receptor 4，TLR4)信号通路在牙周炎相关的心脑血管疾病发生和发展中起重要作用，研究显示TLR-4 能促进动脉粥样硬化时泡沫细胞的形成，并导致粥样硬化斑块的破裂[18]，TLR-2 及TLR-4 能够调节外周血中单核细胞对于炎症因子的反应，在炎症反应时巨噬细胞的浸润中起到重要作用[19]。本研究通过对不同牙周状态的AA 患者的瘤体组织进行免疫组织化学染色，发现中重度牙周炎患者瘤体组织中CD68 表达增加，病变区域细胞间黏附分子ICAM-1 表达增加，并可见TLR-4 及趋化因子的阳性细胞染色增多，表明病变区域炎症反应的增加。ICAM-1 诱导了巨噬细胞在动脉壁的粘附、浸润,巨噬细胞可能诱导MMPs 大量表达，进一步使动脉壁弹力纤维降解,促进AA 的发展；同时，TLR4 的激活可导致NF-κB 活化诱发血管炎症反应，进一步促进巨噬细胞的在瘤体管壁的浸润。这与上述主动脉瘤与牙周致病菌相关的炎性因子表达是相一致的。但本研究中，虽然与中重度牙周炎的AA 患者比牙龈炎或轻度牙周炎的AA 患者MCP-1 阳性染色细胞数量较多，但MCP-1 阳性染色在两组间并无统计学差异，关于瘤体巨噬细胞浸润过程中MCP-1 所发挥的作用，还有待进一步探究。

综上所述，中、重度牙周炎症状态可能诱导了巨噬细胞趋化和炎性细胞因子表达的增加，促进主动脉壁的损伤，从而促进AA 的发展。但二者间具体的作用机制还有待进一步研究。因此，适度的牙周炎症的控制如牙周干预治疗及口腔卫生宣教等，对于主动脉瘤患者来说是十分有益的。