沙门菌和志贺菌双重实时荧光定量PCR 的应用效果评价

熊 辉 广东省深圳市西丽人民医院检验科（深圳，518055）

沙门菌和志贺菌都是引发食品中毒的重要致病菌，特别是对于儿童而言，其危害性非常大，因此这两种细菌也成为疾病预防控制中心对食品和公共场合工作人员每年定期体检的必检项目［1］。 培养法因周期长、操作过程繁琐、主观影响因素多、特异性差等原因而无法满足临床检验需求，导致其临床应用存在一定的局限性［2］。 所以，探讨一种快速、准确、有效的检测方法非常重要也极有必要。 荧光定量PCR 技术具有操作简便、灵敏感高、特异性强等优势而得到广泛运用，尽管当前针对沙门菌和志贺菌的荧光PCR 试剂盒有很多，但大规模临床样本的研究尚未见报道。 基于此，本研究运用双色实时荧光PCR 法对2700 份临床肛拭子样本进行沙门菌和志贺菌检测，并分析其结果，总结汇报如下。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2017 年8 月到2018 年4 月深圳市西丽人民医院职业健康体检人员临床肛拭子样本2700份，运用双色实时荧光PCR 法与培养法同时进行沙门菌与志贺菌的检测。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂。 罗氏荧光定量PCR 仪 （美国Roche 公司），主要试剂包括：PCR Marker（武汉默沙克生物科技有限公司）沙门-志贺菌增菌液（批号：SSB-1701014D），木糖赖氨酸脱氧胆盐平板（批号：XLD-171009D），克氏双糖铁（批号：170914），动力-吲哚-尿素酶生化管（批号：170914），沙门菌显色平板（批号：170925-2），沙门菌多价诊断血清（批号：20170501）， 志 贺 菌 多 价 诊 断 血 清 （ 批 号：20170601），沙门氏菌、志贺氏菌检测试剂盒（批号：17090801）。

1.2.2 培养法。将肛拭子样本置于沙门-志贺菌增菌液中，置于35℃温箱增菌18～24h，3 区划线接种至木糖赖氨酸脱氧胆盐平板， 置于35℃温箱增菌18～24h，于木糖赖氨酸脱氧胆盐平板上筛选出疑似沙门菌和志贺菌的菌落，接种克氏双糖铁、动力-吲哚-尿素酶生化管及血平板， 作初步的生化鉴定和分纯培养，排除一部分非沙门菌和志贺菌后，将其他菌落进行革兰染色、显色平板培养、菌种鉴定以及血清学分型。

1.2.3 双色实时荧光PCR 法。以沙门菌和志贺菌的fimY、ipaH 为目标检测基因， 分别对其进行线上序列比对。 运用Primer Premier 5.0 software 系统设计沙门菌、志贺菌的引物与TaqMan 探针。运用Primer Express 3. 0 software 系统与DNA star 进行排序、分析及评估，优化引物、探针、反应条件等因素。 将沙门菌、志贺菌的标准阳性菌株用GN 增菌液培养8h后，稀释成10-4～10-85 个浓度梯度，分别取50μl 菌液涂HE 琼脂平板各3 个，取相同浓度菌液10μl 作为模板，进行实时荧光定量PCR 检测，统计平板上长出的菌落数， 联合相应的实时荧光PCR 检测结果，计算其准确率。 检测过程严格按照试剂盒说明法操作，为了避免因样品中含有死细菌而造成假阳性检测结果， 使用叠氮溴化丙锭预处理样品基因，使死细胞的DNA 分子与叠氮溴化丙锭发生共价交联，以抑制DNA 分子的PCR 扩增。

1.3 判断标准

阳性标本检测结果Ct 值小于33，待检样Ct 值为33～36，则重新检测，若Ct 值仍为36 或无Ct 值，则直接报告阴性。 如果检出混合标本呈阳性，将对应的10 个标本组合分别划线接种到木糖赖氨酸脱氧胆盐平板上培养，即再用培养法重做一遍，以确认结果，并以此阳性报告为依据。

1.4 数据处理

应用SPPS 19.0 软件对所有数据进行处理，计数资料以%表示， 组间对比采用x2检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2700 份样本中，培养法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为2 株、0 株， 检出率分别为0.07%、0.00%，双色实时荧光PCR 法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为6 株、3 株，检测率分别为0.22%、0.11%，双色实时荧光PCR 法检测法的检出率高于培养法，对比差异有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

表1 培养法与双色实时荧光定量PCR 检测法的阳性检出率对比[n（%）]

3 讨论

沙门菌和志贺菌都是诱发感染性腹泻的主要病原菌，血清分型异常之多，沙门菌高达两千多个血清型，因此其分布也较广［3］。肠炎沙门菌是造成食物中毒的主要病原菌，其他沙门菌血清型还包括猪霍乱、汤普逊等，常通过污染的食物与水源传播［4］。志贺菌是导致细菌性痢疾的病原之一，其流行具有变迁性特点，血清型也会发现演变与进化［5］。当发生感染或食物中毒后，患者经治疗痊愈后，会有少部分人会成为健康带菌者，因无自觉症状，检查不易发现，故将其视为慢性或隐性传染源，此类患者若从事饮食或公共卫生场所服务类工作，则会对周边人群有传染的可能。

对于沙门菌和志贺菌的检测，传统检测方法主要为细菌培养法，这种方法虽然能够达到一定的检测效果，但敏感度不高，而且检测所需的时间较长，所需的试剂较多，因此导致其临床应用存在一定的局限性［6］。 国内外有运用TaqMan 技术检测沙门菌和志贺菌的报道，但常以单一荧光系统检测单一细菌，采取同一种方法同时检测不同病原菌的报道则较为罕见。 随着分子生物学技术的发展，PCR 技术在细菌检测中获得了广泛运用，并在很大程度上提高了检测的速度。双色实时荧光PCR 检测方法的原理是实现目标基因的体外扩增，并使用荧光标记探针及实时荧光PCR 仪采集、分析扩增过程信号。 该检测方法具有较高的特异性及敏感性，能够通过仪器对PCR 产物进行荧光信号检测，所以在一定程度上提高了检测结果的准确度［7-8］。双色实时荧光定量PCR 检测方法还能够实现多病原体的同步检测，省时省力，操作简便，且检测成本较低，能够大大减少后期细菌分离培养与鉴定的工作量，提高检验结果的准确率［9］。操作过程中，尽可能地减少对玻璃器皿的多次使用，减少清洗、灭菌等环节，可大大降低实验室辅助环节污染的风险，继而提高检验质量。 实际工作及临床经验表明，双色实时荧光PCR 法在食物中毒的初筛中极少出现漏检情况［10］，因此，可将其作为国际检测方法的有力补充。

本研究对比培养法与双色实时荧光PCR 法在沙门菌和志贺菌临床检测中的应用价值， 结果显示，双色实时荧光PCR 法检出这两种细菌的阳性率（0.22%、0.11%）均高于培养法（0.07%、0.00%），由此说明，双色实时荧光PCR 法在沙门菌和志贺菌检测中的临床应用价值高于培养法。 然而，因为双色实时荧光PCR 法的检测费用较高，适合大批量的标本筛选，因此目前临床上依然采用培养法。

综上所述，双色实时荧光PCR 法检测沙门菌和志贺菌的临床效果显著，具有较高的特异性、敏感度及准确率，值得临床推广与应用。