陈醋多酚提取物抗氧化活性及抗疲劳作用研究

商全乐，白迎秋，彭一腾

(北京交通大学 海滨学院，河北 沧州 061199)

陈醋是中国四大名醋之一，是由高粱、小麦等为原料经糖化、发酵、氧化、贮陈等一系列工艺酿造而成的[1,2]。陈醋因味道醇厚和营养丰富受到人们的广泛喜爱，也被列为国家非物质文化遗产，具有非常重要的地位。陈醋中除了含有维生素、氨基酸外，还含有丰富的多酚类物质，具有抗氧化、抗菌、降血压、美容养颜等诸多保健功效[3,4]。

陈醋的抗氧化性可能主要源于酚类物质，抗氧化活性的强弱也与酚类物质的含量相关，因为酚类物质可以通过提供化学性质活泼的氢质子与过氧化物结合，从而有助于清除自由基[5]。目前国内外对陈醋的功效研究多集中于抗菌、抗氧化等方面，而对其抗疲劳的效果鲜有报道，这限制了陈醋的进一步开发利用。故本研究利用超声辅助提取陈醋的多酚物质，采用多种指标评价提取物的抗氧化活性，并通过动物实验初步评价其抗疲劳功效，有助于更全面地认识陈醋的功效，也为陈醋的高值化利用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1年陈酿醋：购于山西紫林醋业公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、抗坏血酸等试剂：美国 Sigma公司；羟自由基(·OH)试剂盒：南京森贝伽生物科技有限公司；血尿素氮(SUN)测试盒、肌糖原及肝糖原检测试剂盒：上海通蔚生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

RE-5203型旋转蒸发器 上海青浦沪西仪器厂；UV-1700紫外可见分光光度计 日本岛津公司；电热恒温水浴锅 国华电器有限公司。

1.3 实验动物

清洁级雄性昆明种小鼠(4月龄左右)120只，体重(20±2) g，由北京交通大学医学实验动物中心提供。

1.4 陈醋多酚提取物的制备[5]

将适量陈醋置于1000 mL旋蒸瓶中，在40 ℃真空浓缩30 min左右，直至旋蒸瓶中陈醋变得粘稠。将旋蒸瓶置于超声机中，在40 ℃下用50%乙醇作为溶剂，粘稠陈醋与溶剂体积比为1∶3，提取20 min，即得陈醋多酚提取物。

1.5 总酚含量测定

参考文献[6]，将没食子酸作为标准品，采用Folin-Ciocalteu法对提取物和原料中的多酚进行检测和计算。

1.6 抗氧化活性测定

1.6.1 DPPH 自由基清除活性的测定[7]

配制1 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，取2 mL置于离心管中。将陈醋多酚提取物稀释至50，100，150，200，250 μL/mL，分别取2 mL于离心管中与2 mL DPPH·乙醇溶液漩涡混匀，室温下静置避光反应30 min，在517 nm处测定混合溶液的吸光度值Ax。同时，无水乙醇在该波长处的吸光度值为空白，记为A0。陈醋多酚提取物本身在517 nm处的吸光度值为Ax0。以50，100，150，200，250 μg/mL的抗坏血酸作为对比。

DPPH(%)=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%。

式中：A0为无水乙醇的吸光度值；Ax为混合溶液的吸光度值；Ax0为陈醋多酚提取物的吸光度值。

1.6.2 清除·OH 活性测定

具体步骤按照羟自由基(·OH)试剂盒说明书操作，仍以抗坏血酸作为对比。

1.7 抗疲劳活性测定

1.7.1 实验动物分组

先将120只小鼠在SPF动物房预饲养7 d，均符合实验要求，随后随机分为4组，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，Ⅰ组为阴性对照，即用蒸馏水灌胃；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为实验组，分别用浓度为2，4，8 g/kg的陈醋多酚提取物(溶剂为蒸馏水)灌胃。灌胃计量为0.1 mL/10 g体重，每天定时灌胃1次，总灌胃时间为30 d。

1.7.2 体质量测定

正式灌胃饲养前和最后一次灌胃后，分别称量各组所有小鼠的体质量。

1.7.3 负重游泳实验

第30天最后一次灌胃的1 h后，分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组随机取10只小鼠，称量体重后用橡皮泥制作体重5%的负重物，放在小鼠尾尖向上1 cm处，用保鲜膜包裹好负重物。快速地将小鼠置于水深30 cm、温度25 ℃的水箱中，准确记录小鼠从开始游泳到沉至底部且10 s无法浮上水面的时间，该时间为小鼠负重游泳时间[8]。

1.7.4 SUN、肝糖原、肌糖原的测定

第30天最后一次灌胃的1 h后，再分别从Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组随机取10只小鼠，快速地将小鼠置于水深30 cm、温度25 ℃的水箱中，让其游泳90 min，时间到后马上取出小鼠并摘眼球取血。SUN指标的测定按照试剂盒说明书操作。处死小鼠，解剖，分别取肝脏和大腿处较为健壮的肌肉，肝糖原、肌糖原指标的测定也按照试剂盒说明书操作[8,9]。

1.8 数据处理

所有数据均在SPSS软件中进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 陈醋多酚提取率

经过预实验，确定1.4所述方法为提取陈醋中多酚的最佳工艺，利用该方法，多酚提取率高达95.72%，陈醋多酚提取物中多酚含量为 3.78 mg/mL，说明陈醋中多酚含量较高。较高的提取率以及多酚含量是进一步开发利用陈醋多酚提取物的基础。

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基清除活性

DPPH 自由基是广泛存在的一种自由基，性质比较稳定，当以乙醇为溶剂时，DPPH 自由基在其中呈深紫色。当加入自由基清除剂时，溶液颜色会减轻，自由基清除剂的活性越强，褪色程度越大[10]。由图1可知，陈醋多酚提取物和抗坏血酸具有良好的DPPH 自由基清除活性，且浓度越高清除率越高，呈线性变化。众所周知，抗坏血酸是一种自由基清除剂，能有效清除DPPH 自由基，将其与陈醋多酚提取物作对比，发现陈醋多酚提取物的DPPH自由基清除活性略高。DPPH·清除率与陈醋多酚提取物浓度的线性关系为：y=0.374x+1.7；DPPH·清除率与抗坏血酸浓度的线性关系为：y=0.352x-1.8。

图1 陈醋多酚提取物和抗坏血酸的DPPH·清除活性Fig.1 DPPH· scavenging activity of mature vinegar polyphenol extract and ascorbic acid

2.2.2 ·OH清除活性

·OH也是一种常见的自由基，性质极其活泼，反应速度快，毒性强，会对细胞有损伤，从而诱发疾病，加快衰老[11]。由图2可知，陈醋多酚提取物和抗坏血酸具有良好的·OH清除活性，且浓度越高清除率越高。同样地，将抗坏血酸与陈醋多酚提取物作对比，发现陈醋多酚提取物的·OH清除活性高于抗坏血酸。·OH清除率与抗坏血酸浓度仍呈线性关系，y=0.32x+5.2；而·OH清除率与陈醋多酚提取物浓度是非线性关系，y=16.85ln(x-36.41)。总体来讲，陈醋多酚提取物的清除·OH 活性略高于抗坏血酸。

图2 陈醋多酚提取物和抗坏血酸的·OH清除活性Fig.2 ·OH scavenging activity of mature vinegar polyphenol extract and ascorbic acid

2.3 抗疲劳活性

2.3.1 体质量测定结果

经过30 d的饲养，不论是阴性对照组(Ⅰ组)还是实验组(Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组)，体重均上升了8 g左右。由图3可知，灌胃饲养前后，小鼠体重相差范围在0.68～0.97 g之间，4组间体重增长无明显差异(P>0.05)。

图3 陈醋多酚提取物对小鼠体重的影响Fig.3 Effect of mature vinegar polyphenol extract on body weight of mice

2.3.2 负重游泳时间结果

由图4可知，Ⅰ组小鼠平均负重游泳时间为30.36 min，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠平均负重游泳时间分别为50.46，55.35，56.73 min，与Ⅰ组相比，时间都显著性延长(P<0.01)。结果表明，陈醋多酚提取物可有效延长小鼠的负重游泳时间，即提高小鼠的抗疲劳能力[12]，即使是低剂量的Ⅱ组。

图4 陈醋多酚提取物对小鼠负重游泳时间的影响Fig.4 Effect of mature vinegar polyphenol extract on weight-bearing swimming time of mice

2.3.3 SUN含量

由图5可知，Ⅰ组小鼠平均SUN含量为14.72 mmol/L，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠SUN含量分别为12.31，12.03，11.92 mmol/L，与Ⅰ组相比，SUN含量都显著性减少(P<0.05)，但是随着剂量的增加，SUN含量下降并没有显著性差异。SUN含量可以显示机体运动负荷适应力，因为在运动时，糖原消耗完会开始消耗蛋白质，产生血尿素氮(SUN)，若机体运动适应能力强，则SUN含量低[13]。所以，SUN含量结果表明陈醋多酚提取物能有效提高小鼠的运动能力。

图5 陈醋多酚提取物对小鼠SUN含量的影响Fig.5 Effect of mature vinegar polyphenol extract on SUN content of mice

2.3.4 肝糖原、肌糖原含量

由图6可知，Ⅰ组小鼠平均肝糖原含量为80 mg/g，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠肝糖原含量分别提高了27.5%、42.5%、53.7%，肝糖原含量都显著性提高(P<0.05或P<0.01)，随着剂量的增加，肝糖原含量上升有显著性差异。Ⅰ组小鼠平均肌糖原含量为25 mg/g，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠肌糖原含量分别提高了36%、60%、76%，肌糖原含量都显著性提高(P<0.05或P<0.01)，随着剂量的增加，肌糖原含量上升有显著性差异。不难发现，陈醋多酚提取物对肝糖原和肌糖原的影响趋势是一致的。运动时，肌糖原被消耗尽，机体开始消耗肝糖原，随着肝糖原含量的不断减少，疲惫感随之而来[14]。陈醋多酚提取物能够对肝糖原和肌糖原起作用，从而减轻疲惫感。

图6 陈醋多酚提取物对小鼠肝糖原和肌糖原含量的影响Fig.6 Effect of mature vinegar polyphenol extract on liver glycogen and muscle glycogen content of mice

3 结论

本实验采用超声辅助提取法制备出陈醋多酚提取物，提取率高达95.72%，进一步考察了陈醋多酚提取物的抗氧化活性和抗疲劳效果。DPPH 自由基清除活性、·OH清除活性结果表明陈醋多酚提取物具有良好的抗氧化效果，抗氧化能力与浓度相关，且略优于抗坏血酸。陈醋多酚提取物表现出一定的抗疲劳功效，在没有显著影响小鼠体重的情况下能够延长小鼠的负重游泳时间，降低SUN含量，提高肝糖原、肌糖原含量，提高小鼠的运动适应能力。该研究为陈醋的高值化利用、扩大其应用范围提供了理论依据。