全切片图像扫描技术在病理切片质控中的作用

唐仲平 崔权哲 包 骥 蔡 玮 赵 春▲

1.成都市第一人民医院病理科，四川成都 610041；2.成都市第三人民医院病理科，四川成都 610014；3.四川大学华西医院病理研究室，四川成都 610041；4.四川省雅安市名山区人民医院病理科，四川雅安 625100

数字病理核心是将传统病理图像电子化和网络化，其关键技术包括全切片图像扫描技术（whole slide images，WSI）、图像分析信息学、信息管理系统和数字化体外诊断（IVD）设备。目前，数字病理的用途主要包括四类：教学[1-2]、诊断[3-8]、研究和档案保存[9]。数字病理刚兴起时由于扫描慢、图像差、传输慢、存储贵，只用于部分病理教学实践及少数疑难病例或术中冰冻的远程会诊[10-11]。然而以上几点技术因素在最近均获得了显著进步，所以数字病理在近年推广至日常临床诊断是可行的[12-14]。利用WSI技术将每天产生的所有切片扫描形成数字化切片。本研究以成都市第一人民医院病理科日常工作中连续诊断的300 例组织学病例为对象，由作者在电脑屏幕上阅读数字化切片并评估扫描效果，回顾性分析WSI 技术在日常病理切片的数字化扫描中的应用效果及本科室HE 切片的主要质量缺陷，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经医院医学伦理委员会审核批准，本研究选取成都市第一人民医院病理科300 例[共计493 张病理切片：384 张苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，57 张亚甲基蓝染色切片，52 张免疫组化染色切片]由作者于2015 年9 月诊断的连续组织学病例为研究对象，其中男115 例，女185 例，年龄10 ～92 岁，平均（45±15）岁。

表1 病理常规石蜡包埋HE染色切片质量标准及评分[15]

图1 WSI 技术扫描不同类型的切片得到的数字化图像

1.2 病理检查

本研究病例来自消化系统155 例（60 例胃镜，33 例肠镜，62 例开展其他方式检查），乳腺及女性生殖系统82 例（13 例乳腺，4 例子宫，27 例宫内膜，20例宫颈及宫颈管，8 例输卵管，3 例卵巢，2 例外阴，5 例胎盘），皮肤34 例，软组织与骨10 例，泌尿系统与男性生殖器官7 例，头颈部7 例，造血与淋巴组织3 例，肺、胸膜、胸腺及心脏2 例。

1.3 方法

将病理切片运用Aperio 全自动数字切片扫描系统（美国Aperio Technologies 公司）扫描成数字化切片（20 倍物镜）。按照HE 切片评分标准对数字化切片做出质量评分。见表1。

2 结果

2.1 WSI技术扫描前及扫描中发现的问题及应对措施

在扫描切片前的提片过程中，作者发现2 张粘连的切片和1 张缺失的切片。对此，作者将2 张粘连的切片放入二甲苯中浸泡过夜，第二天将其分离并去除盖玻片后重新封片；对于缺失的切片作者提取其原始蜡块重新切片。493 张切片备齐后，作者在扫描过程中发现5 张切片因自动对焦失败而无法扫描。对此，作者在病理组织上手动选取4 个以上焦点来解决该问题。

表2 HE切片的十项优质标准的得分

2.2 WSI技术的扫描优良率

在用WSI 技术扫描的493 张病理切片中，共有50 张切片的扫描质量存在不同程度的问题，总体扫描优良率为89.86%（443/493）。常规HE 染色切片、亚甲基蓝染色切片及免疫组化染色切片的扫描优良率分别为89.58%（344/384）、85.96% （49/57）及96.15%（50/52）。见图1。

2.3 WSI技术的扫描不良原因及应对措施

笔者将扫描不良的50 张病理切片的原始切片提出来观察，将扫描不良的原因分为五大类：切片不整洁、封片剂收缩、切片裱贴位置不当、切片过厚和扫描机原因，它们在扫描不良的切片中占的比重分 别 为44.00%（22/50），22.00%（11/50），10.00%（5/50），6.00%（3/50），18.00%（9/50）。针 对 上 述五类问题，作者采取了擦拭灰尘，重新封片，重切薄片和调试机器等措施，结果50 张切片重新扫描后全部得到了清晰的数字化图像。

2.4 我科HE切片的优良率

笔者将384 张HE 切片按照HE 染色切片质量标准及评分表的十项标准依次评分，计算出最终得分，并按照切片质量分级标准进行分级。结果发现，我科没有不合格HE 切片且切片的总体优良率较高（99.74%），其中评“优”率为94.27%（362/384），评“良”率为5.47%（21/384），仅有的1 张评“基本合格”的HE 切片来自造血和淋巴系统。评“良”的21 张HE 切片分别来自乳腺及女性生殖系统（38.09%，8/21：宫内物4 张，胎盘2 张，宫颈1 张，输卵管1 张），皮肤（19.05%，4/21），消化系统（14.29%，3/21），泌尿系统与男性生殖器官（14.29%，3/21），头颈部（9.52%，2/21），造血与淋巴系统（4.76%，1/21）。

2.5 我科HE切片的主要质量缺陷

我科384 张HE 切片的得分范围在74 ～100分之间，平均得分为96.269 分，平均扣分为3.731分。按照HE 染色切片质量标准，我科HE 切片的十项优质标准的得分情况见表2。其中，单项平均扣分/总平均扣分大于10.00%的因素包括以下四项：刀痕或裂隙（35.03%），皱褶或折叠（17.45%），切片松散或裱贴位置不当（13.61%），切片厚或厚薄不均（12.09%）。

为了进一步分析我科HE 切片的主要质量缺陷，作者将HE 染色切片质量标准及评分表中的质量缺陷减分进一步拆分成十八个减分项目。如表3 所示，384 张HE 切片共计扣分为1433 分，按所扣分数的多少排序，五个主要的扣分原因依次为裂隙（26.80%），折叠（14.65%），切片裱贴位置不当（9.77%），刀痕（8.23%），切片厚薄不均（7.26%）。如表4 所示，384 张HE 常规病理切片共计扣分项目为519 项（注：同一张切片可有多个项目被扣分），按照扣分项目的多少排序，五个主要的扣分原因依次为裂隙（36.99%），折叠（20.23%），刀痕（11.37%），切片裱贴位置不当（5.39%）， 切片厚薄不均（5.01%）。综合表3 ～4 的数据，我科HE 切片的主要质量缺陷集中在裂隙，折叠，刀痕，切片裱贴位置不当和切片厚薄不均五个问题上。

3 讨论

与传统病理相比，数字病理运用大数据手段促进病理学研究[16-19]。只有数字病理进入日常病理诊断工作，那临床的大数据研究才得以开展。但目前国内外的数字切片并未真正用于病理科日常诊断工作，病理医生依然习惯在显微镜下而非电脑屏幕上进行诊断，这使得病理学的发展很难广泛利用现在蓬勃发展的信息技术。本研究运用WSI 技术将300 例连续的组织学病例的病理切片进行数字化扫描，并由作者阅读数字化切片评估扫描效果，分析WSI 技术在日常病理切片的数字化扫描中的应用效果。

表3 HE切片所扣分数的分布情况

表4 HE切片扣分张数的分布情况

在切片提取过程中，作者发现两个问题：（1）有2 张相邻切片因封片胶过多，而档案管理员在切片未充分干燥时就将切片重叠放在切片柜中而导致切片粘连，无法分开；（2）有1 张切片因未及时归档或归档错误，导致无法在相应位置找到切片。这反映了档案管理员在归档病理资料时的工作疏忽。虽然数量不多，但以后档案管理员一定要在切片充分干燥后将病理切片及时正确地归档。

在扫描过程中，作者发现5 张切片因组织太小导致焦点数目少于4 个，或焦点选在错误的位置（非有效区域）而不在组织上，扫描机无法自动对焦而扫描失败。最主要的原因是临床医生取材过少，所以病理科要经常与临床科室联系，请临床医生尽可能取足够的组织供病理医技人员制片和诊断。其次，可能是病理技师包埋方向不当或修片不够，未将组织最大面完整地展示出来，所以病理医生阅片时若发现组织过小，要请病理技师重新包埋组织或深修蜡块，以暴露组织的最大面。

在用WSI 技术扫描的493 张病理切片中，共有50 张切片的扫描质量存在不同程度的问题，原因有五大类。（1）切片不整洁：切片上灰尘过多，而灰尘跟病理组织不在同一个平面，导致扫描机将灰尘聚焦扫描，而病理组织成像却模糊不清；（2）封片剂收缩：技师封片时滴加封片胶过少，导致封片胶回缩，而扫描机扫描的是组织的单一层面，导致封片胶收缩的区域扫描不清；（3）切片裱贴位置不当：病理切片分为正反两面，正面的右侧为可以做标记的磨砂面，而反面为光滑面。技师捞片时应当将石蜡片贴在正面，封片后在正面右侧的磨砂面贴上病理标签。但偶尔技师在捞片时不慎将石蜡片贴在光滑的反面，封片时却在没有病理组织的正面盖上盖玻片，贴上病理标签。而作者往扫描机里装载切片时是根据标签来判断切片正反，所以这些捞片错误的切片被扫描的是没有病理组织的正面，自然不能得出清晰的图像；（4）切片过厚：细胞重叠，精细的细胞形态难以看清；（5）扫描机原因：传统病理切片并无质量问题，但扫描得出的数字化切片上却出现一些明暗相间的条带，这种情况多出自扫描机自身原因。其中，切片不整洁、封片剂收缩、切片裱贴位置不当这三种原因对数字化切片质量的影响是极大的，会导致病理医生无法根据数字化切片做出诊断；而切片过厚和扫描机原因会导致病理医师在诊断时花费更多时间，诊断正确率也会有所下降。

针对上述五类问题，作者采取了以下措施。（1）对于不整洁的切片，用干净的棉布蘸适量的无水酒精将灰尘擦拭干净；（2）对于封片剂收缩的切片，将其放入二甲苯中浸泡过夜，第二天去除原盖玻片后重新封片；（3）对于裱贴位置不当的切片，将其放入二甲苯中浸泡过夜，第二天去除原来在载玻片正面的盖玻片后，重新在载玻片反面的组织上重新封片。值得注意的是，切忌保留原来在载玻片正面的盖玻片，而直接在载玻片反面的组织上重新封片。虽然这样的切片在显微镜下可以看清，但整个切片太厚，会导致切片无法插入扫描仪的切片槽，或者扫描厚切片时直接导致机器故障；（4）对于切得过厚的切片，提取原始蜡块重新切薄片；（5）对于扫描仪自身造成的问题，联系工程师对扫描仪进行调试校准。经过上述处理后，作者将扫描不良的50 张切片重新扫描，全部得到了清晰的数字化图像。实际上，前四种原因是可以通过病理科医技人员自己控制和避免的，只有第五种的扫描机原因对于病理科工作人员算是一个相对的不可控因素。而493张切片中只有9 张切片（1.83%）是由于扫描机原因而导致扫描质量不佳，这说明运用WSI 技术对日常病理切片进行数字化扫描有着较高的成功率和可行性。

另外，作者还用WSI 技术形成的数字切片进行HE 切片的质控。结果发现我科HE 切片有着较高的优良率（99.74%），仅有1 张基本合格切片，没有不合格切片。那么我科以后的主要目标是将评“良”的切片提升为评“优”的切片。评“良”的切片主要来自：乳腺及女性生殖系统8 张（其中4 张为宫内物）和皮肤4 张，那么宫内物和皮肤是我科制片的难点。宫内物切片不理想的主要原因是病理医生在一个取材盒里装入的组织太多，导致组织脱水不良，技师包埋困难，切片时难以得到完整的组织切面。所以，病理医生应当将宫内膜适量分装在多个取材盒里。而皮肤的组织结构复杂，硬度不一，韧性较大，在切片中常会出现皱褶，脱片等现象，病理医技人员应当优化从取材到制片的整个流程。

本研究还发现，我科HE 切片最常见的质量缺陷包括裂隙，折叠，刀痕，裱贴位置不当和切片厚薄不均五个方面。下面依次分析这些问题出现的原因，探讨解决措施。首先，裂隙的产生主要是因为组织处理的问题。以前我科只有一台全封闭式全自动脱水机，只能将所有标本混合处理，难免会出现标本处理不均的现象。要么大的组织处理不足，要么小的组织处理过度。切片的裂隙多出现在固定不好、偏小、偏薄的组织，特别是细胞成分过多、含水量少的组织易被处理过度，导致质地硬脆。目前，我科已引进一台快速脱水机专门用于小组织的处理，相信这种大小标本分开处理的方式会大大减少裂隙的产生。另外，裱片的水温过高，切片还来不及伸展，切片的石蜡就已经融化，也会导致组织切片出现人为的裂隙。第二，折叠的产生多因裱片的水温过低，切片在水中伸展不开。因此，要将裱片的水温控制在45 ～ 47℃，减少切片人为裂隙和折叠的产生。另外，技术员的展片不佳也是折叠产生的一个重要原因，因此技术员应当多练习来提升自己的技术水平。第三，刀痕的出现可能是由于切片时刀座不稳、使用的一次性刀片松动、切片刀钝、切片角度过于倾斜和切片动作太快太猛等，造成切片时组织出现震颤。所以技术员在每次切片前要仔细检查机器，拧固刀座，夹紧刀片，调整并固定切片的角度。第四，裱贴位置不当主要是由于病理医生取材时组织取得过大以及技术员的责任心不够。只要病理医生取材时掌握好取材的大小和厚度，技术员裱片时将组织片放到玻片中央即可。第五，切片厚薄不均多因切片刀不够锋利或切片机准确度不高、组织脱水不理想。切片过厚会导致脱片、脱蜡困难、染色过深，而切片过薄会导致染色过浅。所以技术员切片前应选择锋利的切片刀，平时勤保养切片机，保持切片机的最佳状态；经常更换脱水液，保持溶液的有效浓度和成分。

更重要的是，本研究发现了很多利用数字化切片做质控优于传统质控的地方。第一，传统切片的每次质控工作都需要将原始玻璃切片从切片夹中找出，阅片后还需将切片归档，即耗时，又有损坏原始切片的风险；而数字化切片一旦形成，可随时观看，一劳永逸。第二，传统切片的质控工作必须依赖显微镜进行，一般只有在病理科才能进行；而数字化切片形成后可经网络上传到云端，所以只要有电脑和网络的地方都可以完成数字化切片的质控。第三，由于传统原始切片只有一张，一般同一时间只能一个人对一张切片进行质控，即使有多头显微镜，同时进行质控的人数也有限制；但数字化切片可以无限拷贝，可以多人在不同的电脑上同时观看进行质控。第四，传统切片随着时间的延长，部分切片会出现褪色的现象，会影响质控的评分；而数字化切片一旦扫描，永不褪色，无论是对日后的复诊和质控都大有益处。第五，传统切片如果要用来参与室间质控，需要邮寄原始切片，即费时，又费钱；而数字化切片可经网络快速传输到相关单位，无论是效率还是经济性都优于传统切片。

总之，本研究论证了WSI 技术在常规病理切片的数字化扫描及质量控制工作中的可行性以及优势。相信在不久的将来，随着数字病理进入日常病理工作技术条件的日益成熟，“互联网+”全数字病理科将是未来病理科发展的必然趋势[20-22]。