植物光呼吸途径的调控和优化策略

周天骄，丁晓辉，王君晖

（浙江大学生命科学学院遗传与再生生物学研究所，杭州310058）

1 植物的光呼吸

植物的核酮糖-1，5-双磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco）是地球上最丰富的蛋白质，它是所有光合生物（如蓝细菌、藻类和陆地植物）催化固定大气中CO2的关键物质。大约30亿年前，Rubisco从一个高浓度CO2和可忽略不计O2浓度的大气环境中进化而来，因此，其作为氧化酶的活性并未体现[1]。然而，由于光合作用的出现，大气中的O2浓度升高，CO2浓度下降，导致Rubisco同时进行羧化反应和氧化反应。Rubisco 固定CO2会产生2 分子的3-磷酸甘油酸（3-phosphoglycerate, 3-PGA），而3-PGA 进入卡尔文循环后合成糖类和其他有机化合物；Rubisco 和O2发生反应会产生1 分子的3-PGA 和1分子的2-磷酸乙醇酸（2-phosphoglycolate, 2-PG）[2-3]。2-PG对植物有毒害作用，它通过限制磷酸果糖激酶和丙糖磷酸异构酶的功能来致使核酮糖-1，5-双磷酸（ribulose-1, 5-bisphosphate, RuBP）再生减少[3-4]。为了去除2-PG并使卡尔文循环的碳损失最小化，有氧光合作用的生物体进化出了光呼吸循环途径（也称为C2循环）[5-6]。在目前的大气φ（CO2）/φ（O2）=0.04%/20.95%下，C3植物1/4～1/3的RuBP 分子被氧化而不是被羧化，所以大多数陆地植物在白天产生大量的2-PG[7-8]。光呼吸将2 分子2-PG 再循环为1 分子3-PGA，相当于75%的有机碳被回收用于合成RuBP，并重新回到卡尔文循环，而25%的有机碳以CO2的形式损失[9]。

2 光呼吸途径的基因通路

在高等植物中，光呼吸循环需要8 种核心酶和几种辅助酶以用于回收Rubisco氧化反应产生的2-PG，各个反应分布在叶绿体、过氧化物酶体、线粒体和细胞质中，因此，光呼吸代谢物的流动需要经过许多膜通道步骤（图1）。迄今为止，仅鉴定出了几种质体转运蛋白：质体乙醇酸/甘油酸转运体（plastidic glycolate glycerate transporter,PLGG1）、质体2- 酮 戊 二 酸/苹 果 酸 转 运 体（plastidic 2-oxoglutarate/malate transporter, DiT1）、谷氨酸/苹果酸转运体（glutamate/malate translocator, DiT2.1）和胆 汁 酸/钠 转 运 体（bile acid sodium symporter,BASS6），而大多数过氧化物酶体和线粒体转运蛋白仍然未知[10-13]。其中，PLGG1 为笔者实验室先前所报道的AtLrgB[14-15]。30 多年前，研究者就预测，在光呼吸途径中，有一个转运体把乙醇酸从叶绿体中运出的同时把甘油酸从细胞质运入[16-17]。我们发现一个由At1g32080基因编码的蛋白被反复报道，但功能未知，于是从美国SALK的T-DNA插入突变体库中鉴定出它的突变体，由于该蛋白的C 端有一个LrgB 结构域，所以将其命名为AtLrgB；在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中它是个孤儿基因，但无论是在低等还是高等植物中，都有它的同源基因[14]。此外，另有学者从日本RIKEN的转座子标签突变体库中发现了该基因的突变体，遵从我们的命名建议，也称它为AtLrgB[18]。另有研究小组从生物信息学的基因共表达分析入手，发现它与植物光呼吸相关的基因共表达，深入研究后发现，它的生化功能是质体乙醇酸/甘油酸转运体[11]。

在叶绿体中，2-磷酸乙醇酸磷酸酶（2-phosphoglycolate phosphatase, PGLP）使2-PG 去磷酸化以产生乙醇酸[19]，乙醇酸由PLGG1和BASS6转运出来，并通过未知的转运蛋白或通道进入过氧化物酶体[11-12,20]。在过氧化物酶体中，乙醇酸被乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase,GOX）氧化为乙醛酸并生成H2O2，H2O2随后被过氧化氢酶（catalase, CAT）分解为H2O和O2。乙醛酸在谷氨酸∶乙醛酸氨基转移酶（glutamate∶glyoxylate aminotransferase,GGAT）和丝氨酸∶乙醛酸氨基转移酶（serine∶glyoxylate aminotransferase,SGAT）的作用下生成甘氨酸；甘氨酸从过氧化物酶体中输出，并被未知的转运蛋白带入线粒体。在线粒体中，甘氨酸脱羧酶复合物（glycine decarboxylase multienzyme system, GDC）和丝氨酸羟甲基转移酶（serine hydroxymethyltransferase,SHMT）联合作用将2分子甘氨酸转化为1 分子丝氨酸、CO2和NH3，并产生还原型辅酶Ⅰ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide, NADH）。丝氨酸从线粒体回到过氧化物酶体中被SGAT催化为羟基丙酮酸，羟基丙酮酸还原酶（hydroxypyruvate reductase, HPR）将产生的羟基丙酮酸还原为甘油酸并消耗NADH。最后，PLGG1将甘油酸转运到叶绿体中，被甘油酸激酶（glycerate 3-kinase, GLYK）磷酸化为3-PGA[21]。最新研究表明，GLYK 在光照下表达编码质体定位GLYK（plastid-localized GLYK, ptGLYK）的长mRNA，但在黑暗中它通过启动子的可变选择表达一个短mRNA，编 码 细 胞 质GLYK（cytoplasmic GLYK,cytGLYK）。cytGLYK构成光呼吸旁路，减轻波动光诱导的光抑制[22]。3-PGA 作为卡尔文循环的中间体可用于RuBP的再生。光呼吸是一个消耗能量的过程，1 mol RuBP 被氧化需要消耗3.25 mol 腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）和2 mol 还原型辅酶Ⅱ（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH），这大概占植物在大气中固定CO2总能量的1/3[23]。

图1 植物的光呼吸途径Fig.1 Photorespiration pathway of plants

在过去的40年中，光呼吸的核心酶及其相应的基因主要是以拟南芥为模式植物被鉴定出来[24]。观察表明，相关酶的缺失会导致光呼吸表型，即突变体只能在高浓度的CO2条件下存活，在大气环境中生长不良甚至致死，所以光呼吸是植物在含氧环境中正常生长所不可或缺的途径[12,25]。它不仅仅是植物脱毒及碳骨架回收的过程，而且已经与氮同化、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA）、碳代谢和硫代谢等途径整合，共同调控植物的生长和发育[26-29]。

3 优化光呼吸途径的方法

在小麦、水稻和大豆等C3作物中，光呼吸使光合作用转化效率降低20%～50%[30]，在高温和干旱条件下甚至更高[31]。因此，优化光呼吸途径长期被视为作物改良的目标[32]，尤其是在世界人口稳步增长、自然资源供应有限和气候变化带来严峻的挑战的背景下。目前，主要通过以下4 个方面调控和优化光呼吸。

3.1 改造Rubisco

虽然Rubisco 在植物代谢中起着核心作用，但它是一种相对低效的酶[33]。Rubisco 一直是基因调控的目标，目的是使其具有更高的CO2特异性和更高的催化效率，但这些努力只取得了有限的成功[34-36]。大多数Ⅰ型Rubisco（发现于陆地植物、绿藻和蓝细菌中）似乎在催化效率和底物特异性之间表现出平衡。因此，通过增强Rubisco对CO2的特异性来降低其加氧酶活性可能会破坏CO2的催化位点，导致较低的酶活性[37]；反之亦然，如果改造具有更高酶活性的Rubisco，必须降低其对CO2的特异性，导致更高的氧化速率[38-39]。但这一特点在来自硅藻的Ⅰ型Rubisco 中没有观察到，它含有碳浓缩机制（carbon concentrating mechanisms,CCM），除了氧化速率较慢以外，还维持着与C3水平相近的酶特异性和羧化转化率[40]。

尽管如此，只是略微改进Rubisco 也可能产生明显的效果。据计算，将红藻（Griffithsia monilis）中的Rubisco 移植到作物中，可使碳同化量增加25%，因为与植物Rubisco 相比，这种酶的CO2特异性/活性比增加了2 倍[35]。然而，将深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）[41]和 蓝 细 菌（Synechoccoccus elongatus）[42]的Rubisco 取代烟草的Rubisco，转基因植物只能在高浓度的CO2环境中生长，与相应的野生型相比显示出严重的生长缺陷。重新改造的S.elongatus转基因植株在高浓度CO2条件下恢复了生长，但与野生型相比，Rubisco 水平显著降低为原来的10%[43]。这表明，原则上可以将高催化性能的外源Rubisco 移植到植物中，但是单独改良的Rubisco能否在田间条件下显著提高光合作用产量，仍有待证明[44]。

3.2 实施CCM

除了直接改造Rubisco外，另外一种途径是通过增加Rubisco 附近的CO2浓度，从而有效地抑制Rubisco 的氧化反应，提高CO2的固定效率[45]。与植物Rubisco相比，蓝细菌进化出对O2更敏感的酶，然而，使蓝细菌在高氧环境中茁壮成长的是它们复杂的CCM。功能性CCM 所需的成分包括Rubisco 周围的羧基体、碳酸酐酶以及无机碳转运蛋白[46-50]。通过使用活性碳酸氢盐转运蛋白和CO2吸收系统，蓝细菌胞质溶胶中积累的无机碳浓度比CCM 突变体高1 000 倍[51]。此外，Rubisco 和Ca2＋被封装在羧基体内，导致Rubisco 活性部位周围的CO2浓度升高；而且羧基体的可选择性渗透蛋白的外壳使内部O2浓度最小化，从而防止浪费的光呼吸[52]。据估计，将一种功能性蓝细菌CCM 移植到C3植物将导致CO2同化量增加36%～60%[53]。即使仅从CCM引入碳酸氢盐转运蛋白，对光合作用也有明显的净效益[53-54]。

另一个研究方向是在无CCM 作物的叶绿体内引入羧基体，预计在高温和干旱条件下可使产量提高60%[53]。功能性羧基体已经在大肠埃希菌中重组，证明其在外源宿主中具有强大的自组装潜力，提高了将羧基体引入其他生物体的可行性[55]。将β-羧基蛋白引入烟草的叶绿体中，自组装出更高级的蛋白结构[56]。在烟草中表达蓝细菌的Rubisco 和羧基体内部结构蛋白CcmM，叶绿体内产生了这2种蛋白的聚合体，类似于早期的羧基组装复合体[42]。这些结果为未来叶绿体功能性羧基体的研究奠定了基础。考虑到每个叶绿体所需的羧基体数目尚不清楚，引入这种复杂的CCM 是对植物有益还是负担仍有待观察[57]。

3.3 优化光呼吸酶的表达

另外一种降低光呼吸对作物产量影响的方法是优化光呼吸酶的表达，加速光呼吸通量，使叶绿体中2-PG 和乙醇酸的积累和毒性效应最小化，从而提高RuBP 再生率，改善植物的生长。有研究表明，植物光呼吸途径的通量受线粒体甘氨酸-丝氨酸转化率的限制[58]。GDC 包含4 个亚基（L、H、P、T亚基），拟南芥GDC不同亚基的过表达支持该假设。H-蛋白[59]或L-蛋白[60]的过表达降低了CO2补偿点，且优化了植物的生长，这可能是由于光呼吸途径的通量增加[61-62]。T-蛋白显然不是一个限制因子，因为其活性的下调或上调都不会影响光合CO2的固定和植物的生长[63]。此外，当植物暴露于高光呼吸压力条件下，烟草中H-蛋白的过表达减少了对光系统Ⅱ的损害[62]。水稻线粒体SHMT的过表达也能够提高水稻的光合效率和植株生产力[64]。在分子水平上，产生上述结果的原因和影响尚不清楚，但线粒体反应的能力似乎可以控制整个光呼吸通量，或以某种方式参与光合活性的调节。近年研究发现，丝氨酸可能作为光呼吸转录调节的代谢信号，进一步支持了这一观点[65]。

与那些有益的作用相比，SGAT 的过表达对植物有负面的影响。在大气环境条件下，过表达SGAT 使植物光合作用的CO2摄取减少，丝氨酸和天冬酰胺消耗增加，从而扰乱C/N平衡，导致植物生长不良[66]。显然，光呼吸与其他代谢途径（如氮代谢）紧密相连，改造任一光呼吸酶也会对其他代谢过程造成影响，所以我们应更好地理解这些代谢途径的相互作用和相互依赖性。

3.4 设计光呼吸旁路

设计光呼吸旁路的目的在于避免线粒体甘氨酸脱羧和NH3的释放，降低光呼吸的能量成本。目前，在模式植物中主要设计了3种光呼吸旁路（图2）。

第1种是在叶绿体中引入甘油酸旁路。该途径在叶绿体中将乙醇酸转化为甘油酸，并释放1 分子的CO2，甘油酸再回到卡尔文循环中[67]。该过程避免了NH3的释放，ATP 消耗少。由于整个过程在叶绿体中进行，因此CO2会在Rubisco 附近释放，从而减少氧化反应[68-69]。将大肠埃希菌的甘油酸途径引入拟南芥、马铃薯和茶树的叶绿体后，转基因植株的光合作用增强，生长速率加快，生物量增加。有趣的是，在叶绿体中单独过表达乙醇酸脱氢酶（glycolate dehydrogenase,GDH）的转基因植株中也意外地观察到生长的改善，这表明需要更多的探究来充分了解叶绿体中发生的生物化学变化[67-69]。

第2 种是在过氧化物酶体中引入甘油酸旁路。在烟草的过氧化物酶体中引入大肠埃希菌乙醛酸醛连接酶（glyoxylate carboligase,GCL）和羟基丙酮酸异构酶（hydroxypyruvate isomerase,HYI），将乙醛酸转化为羟基丙酮酸，进而转化为甘油酸，从而绕过线粒体[70]。虽然这种替代途径可能会降低2-PG回收的成本，但在这些烟草株系中无法检测到HYI蛋白，因此，其对植物产量的影响有待证实[71]。

第3种是在叶绿体中引入苹果酸合成途径。该途径需要表达GOX、CAT 和苹果酸合成酶（malate synthetase, MS），在叶绿体中将2-PG 氧化为CO2，从而绕过NH3的释放，并提高了Rubisco周围的CO2浓度，可以导致生物量增加。这一途径在拟南芥中进行试验表明，转基因植株的光合速率和鲜质量均有所提高[72]。

最近，这些光呼吸旁路经过改造已应用于烟草中。SOUTH等在烟草的叶绿体中设计了3种旁路：1）使用大肠埃希菌乙醇酸氧化途径中的5 个基因；2）使用植物的乙醇酸氧化酶和苹果酸合成酶以及大肠埃希菌中的过氧化氢酶；3）使用植物的苹果酸合成酶和绿藻乙醇酸脱氢酶。同时，利用RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）抑制PLGG1，防止乙醇酸的输出。结果表明，转基因烟草植株的生产力比野生型植株提高了40%[30]。

事实上，自然光呼吸和各种合成旁路之间实际流量的分布仍然难以确定，为了评估这些旁路对植物光呼吸代谢的影响，还应开展进一步的研究工作。

4 展望

光呼吸是植物长期进化中获得的重要代谢途径，可以使植物在含氧环境中健康成长；但它同时又是浪费能量的过程，成为制约作物产量的重要因素。目前已鉴定出光呼吸途径的核心基因通路，然而过氧化物酶体和线粒体的大部分相关转运蛋白和通道仍然未知，还需要进一步探究。另外，更深入地了解光呼吸中间产物在其他代谢途径中的作用也是一个重要的研究方向。目前已有几种调控和优化光呼吸的方法，植株的生物量也有所增加，但是大部分使用的是模式植物，将这些方法应用到主要粮食作物上仍是一个巨大的挑战，且对植物抗逆性的影响还不可预知。尽管如此，优化光呼吸的研究具有良好的发展前景，代谢工程、合成生物学和数学建模等方向的结合为优化光呼吸途径开启了新的大门，有望达到提高农作物产量的最终目的。

图2 3种优化光呼吸途径的方法Fig.2 Three approaches to optimizing photorespiration pathway