鸡FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 基因多态性和聚合基因型与经济性状的关联性分析

孙 杰，任 嵩，张 蕾,秦玉梅,廖和荣

（新疆石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003）

家禽产蛋行为受到下丘脑-垂体-性腺轴三者构成的神经内分泌调节系统的调控，促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone，FSH）和雌激素（Estrogen，E2）作为调控轴上重要的激素，对卵巢卵泡的生长发育、优势卵泡的选择起到主效调控作用[1]。FSH 有2 个常见的α亚基和β亚基[2]，其可促进雌性动物卵泡内膜细胞分化、颗粒细胞增生和卵泡液的分泌，尤其在刺激母鸡的卵泡发育、成熟直至排卵中发挥着促进作用[3]。ESR是一种与特异激素应答DNA 元件相结合的激活转录因子，有ESRα、ESRβ2 种亚型[4]。ESRα和ESRβ在机体组织中分布有较大差异，在阴道至输卵管的上皮中，ESRβ的表达量呈现缓慢增加趋势，而ESRα的表达量则相反，这些差异可能被视为不对称卵巢发育的一个重要原因[5]。IGF-I（Insulin-Like Growth Factor-1）在促进颗粒细胞分泌激素方面与FSH 具有协同促进作用。当卵泡发育至成熟阶段，颗粒细胞增殖活性会逐渐降低，分化能力开始加强并促进孕酮分泌，IGF-I 通过上皮细胞自身受体促进这种分化的实现，使孕酮分泌增加，进而促进排卵[6-7]。有研究表明，雌性大鼠IGF-I 敲除后，卵巢不含窦卵泡，即使用外源性促性腺激素处理后也不能排卵[8]。因此IGF-1 是一种最有效的卵泡生存因子，可有效防止闭锁卵泡现象的发生。鸡卵细胞卵黄生成受体（Oocyte Vitellogenesis Receptor，OVR）是低密度脂蛋白受体家族中的一员，低密度脂蛋白受体家族的成员广泛结合在细胞外配体，位于卵母细胞表面的特殊受体可以介导血液运输的卵黄前体物质通过胞吞作用进入卵巢从而在卵泡中沉积，形成卵黄[9]。

玫瑰冠鸡（Rose Cockscomb Chicken，RCC）的冠形优美，肉质鲜嫩，极具观赏和食用价值，资源群的微卫星多态性分析表明玫瑰冠鸡群体内遗传变异大，遗传多样性丰富，可选择的潜力大[10]，是优质的育种素材。因此运用SNPs 检测玫瑰冠鸡产蛋性能及蛋品质性状相关分子标记，对玫瑰冠鸡的生产养殖和开发利用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品与数据收集 在石河子大学动物科技学院试验站收集健康玫瑰冠鸡242 只、海兰褐蛋鸡176 只的初生重（BW）、开产日龄（AFE）、开产体重（PBW）、开产蛋重（PEW）、300 日龄产蛋数（NE300d）和300日龄平均蛋重（AEW300d）等指标；分别测定31～32 周龄期间的蛋样，测定蛋形指数（EI）、蛋壳厚度（EST）、蛋壳强度（ESS）、蛋重（EW）、蛋白高度（AH）、哈氏单位（HU）、蛋黄颜色（YC）、蛋白重（PW）、蛋黄重（YW）、蛋壳重（ESW）等蛋品质性状指标；同时采集32 周龄的玫瑰冠鸡242 只、海兰褐蛋鸡176只血液2.0 mL，肝素钠抗凝，-20℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计与PCR 扩增 根据GenBank 已经公布的鸡FSHβ基因序列（登录号：AF467082.2）、ESRα基因序列（登录号：NC_006090.4）引物见文献[11]，IGF-1基因序列（登录号NC_006088.4），OVR基因序列（登录号：NC_006127.4）采用Primer5.0 软件在线设计，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR扩增体系15 μL：2×Es Taq Master Mix 6.5 μL，模板DNA 0.5 μL（50 ng/μL），上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），ddH2O 7.2 μL。扩增程序：预变性94℃2 min，变性94℃ 30 s，退火 30 s，延伸72℃ 30 s，32个循环，终延伸72℃ 5 min，4℃保存。PCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2 SSCP 分析和测序 将3 μL PCR 产物和8 μL 上样缓冲液混合，98℃变性10 min，再迅速冰浴10 min，把变性好的PCR 产物10 μL 加于12%的聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=29:1）中，先220 V 电压预电泳10 min，再120 V 电压过夜电泳，银染显色，拍照记录。根据电泳图谱判断基因型，对于存在多态位点的每种基因型挑取5 个样PCR，经电泳鉴定，胶回收试剂盒回收目标片段，纯化后送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 统计分析 统计各基因型个数，采用SPSS 19.0 计算基因型频率和基因频率。基因与性状之间的关联分析运用SAS V8 软件，建立GLM 模型进行最小二乘分析：单基因型效应关联分析Yij=μ+Gj+eij；聚合基因型关联分析Yij=μ+FSHβ基因型效应+ESRa 基因型效应+IGF-1基因型效应+OVR基因型效应+基因型间互作效应+eij，其中Yij为性状观察值，μ 为群体均值，Gj为标记基因型效应，eij为随机残差效应。组间差异结果用均值±标准误差表示。基因的纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）的计算公式如下：

式中,Ho 为某一位点的基因纯合度，Pi 为第i 个等位基因的频率，n 为某一位点的等位基因数。

式中，He 为某一位点的基因杂合度，Ho 为某一位点的基因纯合度。

Ne=1/Ho

式中，Ne 为有效等位基因数，Ho 为某一位点的基因纯合度。

式中，Ho 为某一位点的基因纯合度，n 为某一位点的等位基因数，Pi 和Pj 分别为第i 和第j 个等位基因在群体中的频率。

表1 引物序列信息

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP 检测结果FSHβ、ESRα基因PCR-SSCP检测分别存在A-173G、C-158689G 突变位点[11]，IGF-1和OVR基因的PCR 产物经SSCP 分析后，玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡均检测到AA、AB 和BB 基因型（图1、2），将各基因型PCR 扩增纯化后测序并与GenBank的序列比对发现IGF-1基因存在A-38965G 突变位点（图3），该位点发生在外显子3，导致第94 位氨基酸由Glu（GAA）突变为Glu（GAG）。OVR基因存在G-10394T突变位点（图4），位于外显子11，导致第588 位氨基酸由Gly（GGC）错义突变为Cys（TGC）。

2.2 基因型频率及等位基因频率 统计FSHβ、ESRα结果见[11]，突变位点A-173G、C-158689G 的等位基因A是2 种鸡的优势等位基因；IGF-1、OVR基因扩增产物经SSCP 分析后的各基因型数，计算遗传结构指标见表2。在A-38965G 位点，等位基因B 是海兰褐蛋鸡的优势等位基因。G-10394T 位点，玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡均是AB 基因型略占优势，A 基因频率高于B。PIC 都处于中度多态。χ2检验表明，海兰褐蛋鸡在G-10394T位点处于不平衡状态（P＜0.05）。

2.3 候选基因多态性与产蛋性能、蛋品质性状的关联分析 玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡FSHβ和ESRα基因A-173G位点、C-158689G 位点的基因型与性状关联分析见[11]。

IGF-1、OVR位点的不同基因型与产蛋性能、蛋品质性状作关联分析，结果如表3所示，玫瑰冠鸡A-38965G突变位点AB 型AFE 和NE300d与AA 型差异显著，AB型EW、HU 和PW 显著高于BB 基因型，与AA 型差异不显著。海兰褐蛋鸡BB 型AFE 显著早于AA 型，NE300d、AEW300d显著高于AB 型，略高于AA 型。可将BB 型视为海兰褐蛋鸡产蛋性能的优势基因型。

玫瑰冠鸡G-10394T 突变位点AB 型的AFE 与NE300d均显著高于AA 型和BB 型。AB 型HU、PW 和ESW 比BB 型分别显著高出14.17%、17.19%、64.11%，可将AB型视为该位点优势基因型。海兰褐蛋鸡BB 基因型的AFE、AEW300d显著高于AB 基因型，EW 和YW 显著高于AB 型9.92%、24.57%，ESW 高于AA 型49.14%。

2.4FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因聚合与产蛋性能的关联性分析 综合分析FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因多态位点与产蛋性能、蛋品质性状关联性，将4 个位点基因型聚合共60 种，仅对频率高于5%的基因型与产蛋性能、蛋品质性状进行关联分析，结果如表4 所示，聚合基因型GP6 的频率在玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡中均为最高，分别是13.84%和14.20%。

由表5 可知，玫瑰冠鸡聚合基因型GP3 的BW 显著高于GP1、GP2，GP5 的AFE 显著早于GP6，NE300d极显著高于GP2、GP3、GP6，显著高于GP1 和GP4，GP5 是优势聚合基因型。海兰褐蛋鸡聚合基因型GP6和GP10 的BW 显著高于GP7、GP8，GP6 的AFE 极显著早于GP7、GP9，GP6 和GP10 的NE300d极显著高于GP7，可将GP6 视为海兰褐蛋鸡优势聚合基因型。

表2 基因型频率、基因频率及群体遗传结构指标

表4 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 部分聚合基因型频率分布

表5 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 聚合基因型与产蛋性能关联分析（最小二乘均值±标准误）

2.5FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR聚合基因型与蛋品质性状的关联性分析 由表6 可知，玫瑰冠鸡聚合基因型GP3 的ESS 极显著高于聚合基因型GP1、GP2；GP1、GP4 的HU 显著高于GP3，与GP2、GP5、GP6 差异不显著；GP4 和GP6 的PW 显著高于GP1，因此可将GP4 视为玫瑰冠鸡蛋品质性状的优势聚合基因型。

表6 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 聚合基因型与蛋品质的关联分析（最小二乘均值±标准误）

海兰褐蛋鸡聚合基因型GP8 的HU 极显著高于GP6和GP7，显著高于GP9，GP7 的EW、PW 均显著高于GP10，高于聚合基因GP6、GP8（P＜0.05），YC、YW及ESW 均高于其他聚合基因型而差异不显著。综合分析，可将GP7视为海兰褐蛋鸡蛋品质性状的优势聚合基因型。

3 讨 论

3.1FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因多态性与产蛋性能、蛋品质性状的关联性分析 本研究结果显示，FSHβ基因A-173G 突变位点中AB 型、BB 型分别是玫瑰冠鸡和海兰褐蛋鸡AFE、NE300d 相关的优势基因型。Li 等[12]在苏肯鸡FSHR 启动子区域SNP 检测到C-1684T 位点TC 基因型的AFE 显著高于CC 基因型，C-1608T 位点CC 基因型AFE 显著高于TC 基因型，东乡鸡C-1684T 位点CC 基因型在43 周龄产蛋数显著高于TC 基因型，表明FSH 与鸡的产蛋性能密切相关，与本研究结果相似。

ESRα基因C-158689G 位点的突变导致第441 位氨基酸由Cys 转变为Trp，属于有义突变，其中玫瑰冠鸡AB 型显著影响NE300d、AEW300d；海兰褐蛋鸡BB 基因型NE300d显著高于AA 型，高于AB 型但不显著。周俊等[13]报道，ESRα基因5'侧翼调控区的CC 型和CD 型36 周平均产蛋量差异显著，没发现DD 型。鹌鹑ESRα基因外显子1、8 的突变位点分别与AFE、PEW 有一定关联性[14]。以上研究均表明，ESRα基因存在单核苷酸多态性，且与家禽的产蛋性能密切相关。

IGF-1基因检测到在A-38965G 存在碱基突变位点，导致第94 位氨基酸由Glu 同义突变为Glu。OVR基因的G-10394T 多态位点使第588 位氨基酸由Gly 错义突变为Cys，PIC都处于0.289～0.381，属于中度多态。Nagaraja等[15]、Bian 等[16]在IGF-1基因上均发现多态位点，其多态性及不同的单倍型组合对2～12 周龄的ESW、EW、体重及料蛋比有显著影响。Abdalhag 等[17]研究表明IGF-1基因存在点突变g.295T＞C，发现CC 基因型与PEW 显著相关。Wang 等[18]研究发现OVR基因2 个SNP 位点分别与鸭的产蛋量、AFE 和PBW 呈显著或极显著相关，与本实验结果相似。同义单核苷酸多态性不产生改变的编码序列，因此预期它们不改变自身指导合成的蛋白质功能，但Kimchi 等[19]已经证实不改变蛋白质序列的同义突变也会影响蛋白质功能，且Gartner 等[20]研究了癌症基因组学领域的同义突变，结果表明同义改变在人类癌症中发挥作用。因此碱基的转移、颠换偏差和密码子频率偏差对同义和非同义突变率的评估都具有显著影响。

3.2FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR聚合基因型与产蛋性能、蛋品质性状的关联性分析 家禽产蛋性能、蛋品质性状等遗传改良传统上仅限于使用定量遗传方法，这些性状受多基因以及环境因素控制。研究表明单个遗传标记效应相对较小，从单基因角度进行分子辅助育种不能达到全面提升经济性状的目的，聚合基因型方法比单个SNP分析更加完善，可提供更加丰富的遗传信息[21]，通过优势基因型的有效整合，更有利于利用标记辅助选择对畜禽进行遗传改良。本研究结果表明，玫瑰冠鸡聚合基因型GP3 和GP5 极显著影响ESS 和NE300d，是优势聚合基因型；海兰褐蛋鸡聚合基因型GP6 的AFE、NE300d显著高于其他基因型。本实验表明，单个基因型多态位点与产蛋性能、蛋品质性状间达到不同程度显著关联，但聚合基因型与部分产蛋性能、蛋品质性状间达到极显著差异。洪坤月等[22]检测了太湖鸡PRL、PRLR 和FSHβ基因的多态性，发现聚合基因型AADD 是产蛋量的有利基因型。优质肉鸡M 系NPY、NCOA-1、IGF-1和GDF-9聚合基因型AaBBCCGg 基因型在AFE、PBW 和300 日龄合格种蛋率上显著优于其他基因型，可作为有效改良优质肉鸡繁殖性能的候选标记[23]。Du 等[24]研究湖羊FSHR5'侧翼序列的约1.5 kb 区域，检测到4 种变异体（c-518T＞C、c-466C＞ T、c-414A＞ G 和c-365C＞T），发现6 种基因型和3 种单倍型，关联分析显示这些多态性与湖羊的产仔数有关。采用优良基因聚合的育种方法，不同基因可能控制相同性状，也可能控制不同性状，由于不同性状之间的代偿作用，或者聚合基因型后使得与单个基因型有关联的个体数分散，分布不均匀，使得本研究分析中与产蛋性能、蛋品质性状相关联的指标很少，但个别表现出极显著差异，这也说明基因型的不同组合对于基因中的某些突变模式和其他细胞周期调控具有选择性优势，突破了传统育种技术改良动物个体性状的局限，使品种在多个性状上同时得到改良，产生更有价值的育种材料。

4 小 结

本研究采用SSCP 技术检测到FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR均存在多态位点，与玫瑰冠鸡产蛋性能、蛋品质性状关联分析表明，ESRα和IGF-I的AB 型分别是调控NE300d和AFE 的优势基因型，OVR基因的BB 型是调控ESS 的优势基因型。FSHβ-ESRα-IGF-1-OVR聚合基因型GP4（AAABABAB）是调控HU 的优势基因型，聚合基因型GP5（AABBAAAA）的BW、AFE、NE300d均表现优势。以上标记均有望作为玫瑰冠鸡产蛋性能与蛋品质性状相关的分子标记。