从江香猪OB 基因序列及对皮下脂肪前体细胞的调控研究

朱晓锋 ，谢玲玲，许厚强，田念念，崔小芝，吴巧群，李 雄，杨 云，倪萌萌*

（1.贵州大学动物科学学院高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州省种畜禽种质测定中心，贵州贵阳 550018；3.思南县畜牧发展中心，贵州铜仁 565100）

肥胖基因（OBsese，OB）于1954 年在小鼠中被首次发现，属于常染色体隐性遗传，直到1994 年，Zhang 等[1]利用定位克隆技术成功克隆出小鼠的OB基因及人类的同源基因序列，其表达产物为瘦素蛋白（Leptin），是一种主要由脂肪细胞分泌的可调节体内脂肪储蓄量的内分泌因子[2]。第1 个外显子氨基酸N-端的2 个半胱氨酸形成内二硫键并以单体形式存在于血液中[3]，对能量代谢、体器官发育、动物繁殖以及造血系统均具有一定的调节功能[4]。例如，当OB基因或OBR基因突变导致瘦素不能正常表达时，可导致动物不育，用瘦素刺激生殖内分泌系统可恢复不育动物的生育能力[5-6]，于是Huertas 等[7]通过抑制OB/OBR轴实验探究性地开发了抵抗炎症缺陷的治疗方法。也有研究证实下丘脑是瘦素长型受体分布的主要部位，瘦素直接或间接与NPY、POMC（Proopiomelanocortin，促黑素细胞皮质素原）神经元结合，进而投射到LHA（Lateral Hypothalamic Area，下丘脑侧翼区），参与瘦素代谢循环以调节动物的摄食和体重稳态[8]，是因为二酰基甘油酰基转移酶1基因（Diacylglycerol acyltransferase 1，DGAT1）参与着脂质产量合成[9-11]。ACACA作为脂肪合成过程中的限速酶，则伴随成熟脂肪细胞的增殖而优先表达[12-15]，随着ACACA的表达，脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FASN）也随即表达，主要参与乳腺短链、中链脂肪酸的合成[15-18]，而且FASN基因上存在的多个与脂肪呈显著相关的SNPs，直接影响着FASN奶牛乳脂的合成和代谢[19-20]。也有研究证实脂蛋白脂酶（Lipoprotein Lipase，LPL）和过氧化物酶体增殖激活受体γ（Peroxisome Proliferator Activated Receptorγ，PPARγ）参与AKT 信号通路，影响奶牛乳脂含量和脂肪酸组成[21-22]。目前国内外关于畜禽OB基因的报道较少，对OB基因调控脂质代谢的分子作用机制尚且模糊。

从江香猪属于我国地方小型猪种之一，有着生长迟缓、个体矮小等优良的地方猪种种质特性，在医疗及模式动物的资源挖掘方面有着特殊的价值[23]。本文以从江香猪脂肪组织mRNA 为模板，结合RT-PCR、在线软件及测序方法完整克隆、分析了OB基因全长编码区序列，利用实时荧光定量PCR 方法检测分析OB基因在不同猪种不同组织中的mRNA 表达情况；构建OB基因的表达载体，瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞，初步探究从江香猪OB基因的分子作用机制，为构建从江香猪肥胖动物模型提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 实验动物来自贵州大学香猪育种场，选取饲养环境相同的纯种从江香猪、大白猪和苏香杂交猪作为实验对象，根据国家屠宰标准进行屠宰。按实验需要立即采取动物心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪、背最长肌9 个组织器官样品，经灭菌后的DEPC 水处理，用灭菌锡箔纸包好并分别写上标记，放入液氮罐中暂时保存，后置于-80℃冰箱待用。

主要实验试剂：2×Taq Master Mix、DM2000 Marker购自康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶及逆转录试剂盒与LipofectamineTM3000 细胞转染试剂盒购自赛默飞世尔（Thermo）科技有限公司；RNA 提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自莫纳生物科技有限公司（珠海）；pMD19-T 载体、质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；实时荧光定量PCR仪BIO-RAD CFX96TMReal-Time System（美国）购自广州安邦生物科技有限公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 目的基因的克隆 根据GenBank 中公布的猪OB基因的序列（序列号为：U63540.1），运用Primer Premier 5.0 软件设计从江香猪OB基因的扩增引物，由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成，引物序列信息见表1。Trizol 法提取从江香猪不同组织器官的总RNA，RTPCR 进行cDNA 第一条链的合成。逆转录步骤：向无核酸酶的PCR 管中加入Oligo(dT) 1 μL、随机六聚体引物1 μL、组织模板总RNA 1 μL，用nuclease-free water补足12 μL，然后65℃孵育5 min，再向以上得到的12 μL混液中加入10× dNTP Mix 4 μL、5×Reaction Buffer 2 μL、RevertAid Reverse Transcriptase 1 μL、RiboLock RNase Inhibitor 1 μL，轻微震荡离心后放入PCR 仪，反应程序为：42℃ 60 min，75℃ 5 min，4℃短暂保存，后将组织cDNA 置于-20℃备用。

以从江香猪组织cDNA 为模板扩增OB基因CDS 区504 bp，反应总体系20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上下游引物各1.5 μL，cDNA 模板1 μL，nuclease-free water 补足至20 μL。PCR 程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，35 个循环，72℃补充延伸7 min。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。电泳条带正确后，纯化片段连接pMD19-T 载体，转化于JM109 感受态细胞中，筛选出阳性单菌落，经重庆擎科兴业生物技术有限公司测序鉴定，获得从江香猪OB基因序列。

1.2.2 从江香猪OB基因真核表达载体的构建 将1.2.1中测序正确的菌液进行质粒提取，用限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ分别同时双酶切pMD19-T-OB质粒和pEGFP-C1空载体，酶切体系：10×Fast Digest Green Buffer 3 μL、Fast Digest enzyme 1.5 μL、质粒4 μL、nuclease-free water补足30 μL。回收纯化酶切的片段，16℃连接过夜，连接液转化至JM109 感受态细胞中，卡纳抗生素培养基筛选阳性单菌落，扩大培养后提取重组质粒，进行双酶切检测和测序鉴定，测序鉴定正确的重组质粒，经无内毒素质粒提取试剂盒抽提，用于细胞瞬时转染。

表1 相关基因引物序列信息

1.2.3 从江香猪OB基因序列及结构分析 通过测序结果，结合在线软件分析OB基因蛋白质的理化性质（https://web.expasy.org/protparam/）、二级结构（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、三级结构（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）、跨膜结构域（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、亚细胞定位（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）及信号肽位点等，利用RNA Web Services（http://rna.tbi.univie.ac.at/）检测其最小自由能。通过NCBI 数据库查找野猪（Sus Scrofa）、人（Homo Sapiens）、猕猴（Macaca Mulatta）、黑猩猩（Pan Troglodytes）、绵羊（Ovis Aries）、山羊（Capra Hircus）、家犬（Canis Lupus Familiaris）、猫（Felis Catus）、鸡（Gallus Gallus）、大鼠（Rattus Norvegicus）、小家鼠（Mus Musculus）和斑马鱼（Danio Rerio）OB基因的开放阅读框，利用Bio Edit 软件分析从江香猪OB基因与该13 个物种核酸序列一致性，通过MAGA6.0 软件构建OB基因CDS 区序列的系统发育树。

1.2.4 不同猪种OB基因各组织表达及差异分析 利用实时荧光定量PCR 仪（BIO-RAD CFX96TMReal-Time System）检测OB基因在大白猪、从江香猪、苏香杂交猪3 个猪种心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪、背最长肌9 个组织器官中的表达量，反应总体积为10 μL：5 μL NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus、上下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 组织cDNA 模板、ddH2O 补足10 μL。qPCR 反应程序：95℃预变性3 min、95℃变性5 s、60℃ 15 s，40 个循环，熔解温度为65～95℃，温度每升高0.5℃记录一次荧光信号。结果采用2-△△Ct法计算各组织器官的表达量，运用PASW Statistics18.0 进行表达差异及显著性分析，并用Excel 作图。

1.2.5 从江香猪皮下脂肪前体细胞瞬时转染及表达检测 本研究通过组织消化法培养从江香猪皮下脂肪前体细胞，经鉴定成功后进行细胞转染实验。六孔板培养从江香猪皮下脂肪前体细胞至细胞数量达80%左右，利用LipofectaminTM3000 细胞转染试剂盒将1.2.2 中的pEGFP-C1-OB表达载体和pEGFP-C1 空载体分别转染至皮下脂肪前体细胞，24 h 观察荧光发光效果，并作记录。转染48 h 后，Trizol 法提取从江香猪前体脂肪细胞总RNA，并进行cDNA 第一条链的合成，在线（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计脂质代谢相关基因的荧光定量PCR 引物（表2），qPCR 程序和体系与1.2.4 中一致。

2 结果与分析

2.1 从江香猪OB基因克隆及序列分析 通过PCR 扩增获得OB基因CDS 区全长序列，经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，与预期条带大小吻合，且清晰、明亮（图1-a）。产物送往昆明硕擎生物科技有限公司测序，纯化后获得从江香猪OB基因504 bp 全长序列。经序列比对分析，从江香猪OB基因CDS 区全长504 bp，序列分析显示，该基因起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，包含2 个外显子，共编码167 个氨基酸，其中与GenBank 登录的野猪（Sus Scrofa）序列相比较，有两处突变，分别为241 bp 处（T →C）和462 处（G →T），两处碱基突变均未导致氨基酸变异，为同义突变，说明该基因在两猪种中存在高度保守性，但在不同亚种间存在碱基差异。突变前后RNA 二级结构预测结果显示，野猪的最小自由能为-191.20 kcal/mol（-799.98 KJ/mol），从江香猪的最小自由能为-163.90 kcal/mol（-685.76 KJ/mol），野猪序列较从江香猪序列稳定。

表2 脂质代谢相关基因引物序列信息

2.2 从江香猪OB 蛋白（Leptin）结构与功能分析 理化性质分析显示，从江香猪Leptin 蛋白分子式为C1488H2474N504O613S166，由5 245 个原子组成，分子量是42.554 98 ku，理论等电点为5.13，该蛋白为酸性蛋白质。脂肪系数19.44，半衰期4.4 h，不稳定系数高达58.61，说明该蛋白质属于不稳定蛋白。序列分析得知，该蛋白质含丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Cly）和苏氨酸（Thr），其中胱氨酸含量最高（32.9%），丙氨酸最低（19.4%）。从江香猪Leptin 蛋白疏水性得分在第96 位氨基酸最高（2.189），在第33 位氨基酸最低（-0.244），总的疏水性平均系数（Grand Average of Hydropathicity，GRAVY）为0.919，可以推测该蛋白属于疏水蛋白（图2-A）。从江香猪Leptin 蛋白结构预测结果可见，二级结构中以α-螺旋为主要结构形式，比例占61.68%，其次无规卷曲，占28.74%，延伸链占7.19%，而β-转角占比最少，为2.40%，结构中不含β-折叠，依据Rost 等[24]所述的判断方法，从江香猪Leptin 蛋白属于全α-类蛋白质，通过在线软件phyre2对蛋白进行同源统计计算并构建隐马尔可夫三维模型（图2-B）。结构域预测显示，第1 位至22 位为蛋白信号肽区域，概率为86.61%；存在一个螺旋跨膜结构，概率为84.63%；第99 位至第111 位为一个低复杂度区域（氨基酸序列：NDLENLRDLLHLL），亚细胞定位为细胞核中。

2.3OB基因表达载体的鉴定 将重组质粒纯化后，经限制性内切酶Hind Ⅲ、BamH Ⅰ进行单、双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，经鉴定，可用于下一步细胞转染实验。

2.4OB基因在各猪种不同组织中的表达差异分析 以野猪（Sus scrofa）的GAPDH基因为内参，将各猪种心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪、背最长肌9 个组织器官样品进行均一化处理后，进行实时荧光定量PCR，每个样品设置3 个重复。

qRT-PCR 结果表明，OB基因属于广谱表达基因，在大白猪、从江香猪和苏香杂交猪的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、脂肪、背最长肌9 个组织器官中均有不同程度的表达，在各猪种脂肪组织中表达均极显著高于其他组织。从江香猪OB基因在脂肪组织中表达量最高，极显著高于其他组织，且在心脏、肺脏、肾脏仅存在微量表达；在脾脏、小肠、背最长肌中虽有中度表达，但表达量依然很低，与大白猪的各组织器官表达量差异不明显（图3-A）。苏香杂交猪的不同组织中OB基因的表达量在与大白猪和从江香猪比较中有很大的不同，除了在心脏、肾脏和背最长肌中低表达外，在其他几个组织中均呈现中高度表达（图3-B）。OB基因在不同猪种中的表达有很大差异的结果与戴茹娟等[25]报道的一致。OB基因的高表达也直接反映了畜禽肉质产品的口感和风味[26]。

2.5 从江香猪OB基因在物种间的遗传进化分析 如图4 所示，从江香猪与野猪的同源性最高，为99.6%，其次是反刍动物中的绵羊、山羊和牛，分别为93.3%、92.9%和92.3%，家与鸡的同源性最低，约为42.1%，结果与李琴等[27]报道的相吻合。分析可知，OB基因在物种间的遗传上具有一定的保守，同属物种间的遗传距离较近，且在进化树上聚为同一分支；不同属的物种间遗传距离相对要远，并分别聚于不同分支，说明OB基因的遗传存在种间差异，不同种属间差异较大。

2.6OB基因上调对从江香猪脂质代谢的影响 分别将3组实验组（pEGFP-C1-OB载体）和空白对照组（Blank）瞬时转染至培养的从江香猪原代皮下脂肪前体细胞中，各组OB基因的表达结果如图5 所示，各实验组中OB基因的表达量均显著高于空白对照组；表达载体上调OB基因表达，脂质代谢相关基因ACACA、NPY、GPAM的mRNA 水平均显著上调，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN的mRNA 水平均极显著下调。

3 讨 论

部分研究表明OB基因在不同物种、不同组织中的表达有着极显著的差异，且只有在成熟的脂肪组织中才有表达，而在人和小鼠的其他组织中均检测不到OB基因的转录物[28]，反刍动物和家禽中没有检测到OB基因的表达。也有研究表明，OB基因的表达产物还存在性别差异，女性血清中的瘦素水平高出男性2～3 倍，且有伴随着明显的周期波动趋势[4]，还有学者认为一定有某种信号反馈机制来维持动物体重在一定的范围内。可见，伴随着人们生活水平的提高，肥胖研究已经成为倍受关注的话题，但对肥胖基因调控地方畜种生命活动分子机制的研究较少，给本实验研究从江香猪肥胖症动物模型带来一定的阻力。

本研究利用生物信息学有关数据库、在线序列结构分析软件、qRT-PCR 方法，对从江香猪OB基因进行序列及组织表达分析，结果显示，突变后RNA 自由能降低了27.3 kcal/mol（114.27 Kj/mol），这一突变可能与其RNA 在从江香猪脂肪组织中的高表达有关[2]。基因编码区核酸序列与其他12 个物种间比较结果表明，与野猪的同源性最近，不同种属间的遗传距离较远，并且对应的各重要性氨基酸具有高度的保守性[29]。OB基因在纯种从江香猪脂肪中的表达量极显著高于其他组织，且脂肪组织表达量极显著高于大白猪，说明纯种从江香猪属于脂肪型猪种。然而，在苏香杂交猪各组织中出现了多个组织高表达现象，说明苏香杂交猪仍保持着脂肪型猪种的表达特征，但造成这种现象的机制目前尚不清楚[30]。细胞转染实验表明，从江香猪皮下脂肪前体细胞中OB基因的过表达能导致NPY、ACACA、GPAM基因的mRNA 表达水平极显著上调。有研究显示，乙酰辅酶A 羧化酶A 作为脂肪酸合成的关键限速酶，可与乙酰辅酶A 作用生成丙二酸单酰辅酶A，进而在脂肪酸合成酶的作用下生成软脂酸，软脂酸经高尔基体加工合成为多种脂肪酸。Mercer 等[31]利用基因敲除技术培育出OB/OB缺陷小鼠，发现NPY基因在其下丘脑中出现超表达现象，利用瘦素处理后，小鼠下丘脑的NPY的mRNA 合成明显降低，与本研究结果相符。Li等[32]成功鉴定了线粒体GPAM为miR-223 的靶点，并验证了miR-223 通过靶向GPAM抑制肌内脂肪细胞分化。由此可见，NPY、ACACA和GPAM均是影响脂质合成代谢的关键性基因。Lan 等[33]研究发现，PPARγ的mRNA 和蛋白质的水平受到一种新型长链非编码RNA（lnc-HC）的负调控，通过减少lnc-HC 表达显著减少miR-130b-3p 的表达量，诱发PPARγ表达，从而增加了高脂血症大鼠肝脏中的甘油三酯浓度。本研究发现，OB基因的过表达能使DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表达量极显著下降，证实了OB基因的表达能够影响DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表达，但是它们之间相互调控的具体机制尚不清楚。本研究提示NPY、ACACA、GPAM与OB基因之间可能以正调控方式参与脂肪的合成代谢，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN可能作为OB基因表达的负调控因子发挥重要的生物学功能。

本研究发现了OB基因在纯种从江香猪和苏香杂交猪种上的表达差异，在杂交猪的肝脏、脾脏、肺脏、大肠、小肠和脂肪中均出现了中高度表达，与叶鼎承等[26-28]报道的结果有差异，这种差异可能是由于杂交猪和纯种地方猪之间的不同导致的，具体原因还有待进一步实验证实。此结果可为从江香猪新品系选育和提高猪肉品质提供新的思路，也可为预防和治疗脂肪相关疾病动物模型提供参考资料。OB基因的上调可导致脂质合成代谢相关基因不同程度的高表达或抑制，揭示OB基因的表达作用由多基因、多种调节方式、多个作用因子构成，为进一步研究OB基因在肥胖症中的作用机制提供基础理论。

4 结 论

本研究克隆了从江香猪OB基因包含两个外显子的全长编码区序列，在线分析其理化性质及结构功能发现，OB基因表达蛋白为不稳定酸性蛋白，分子量为42.554 98 ku，在遗传上存在高度保守性，与野猪的遗传距离最近。运用qRT-PCR 检测到OB基因在从江香猪脂肪组织中的mRNA 表达水平极显著高于其他组织，且不同猪种中的表达量有很大差异。构建pEGFP-C1-OB表达载体转染从江香猪皮下脂肪前体细胞，发现NPY、ACACA、GPAM基因的表达水平上调，而DGAT1、LPL、PPARγ、FASN基因的表达受到抑制，揭示了OB基因在动物脂肪合成和代谢过程中发挥着的重要作用，结果可为进一步研究OB基因调控脂质细胞代谢的分子机制提供基础理论数据。