稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3衣壳蛋白的Vero细胞系的构建

蒋再学 陆小梅

（东莞市儿科研究所 广东 东莞 523325）

手足口病（HFMD）是儿童常见传染病，重症者可以引发神经系统损伤、甚至死亡[1-3]。研究表明柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71)是导致HFMD的主要致病原[4-5]。疫苗的使用可以有效的防控病毒的传播,目前临床使用的EV71灭活疫苗需要多次免疫且存在一定的安全隐患，因此研制免疫保护周期长且安全有效的EV71疫苗具有重要意义。

近年来基于甲病毒等正链RNA病毒的RNA复制子作为疫苗载体已有较多研究，这种RNA复制子载体具有无DNA整合、高表达效率等优点[6-7]。RNA复制子载体包含病毒基因组5’和3’末端的非编码区、非结构蛋白基因编码区，其结构区被外源基因所取代，外源基因由病毒基因组启动子控制表达。表达外源抗原的RNA复制子可有3种形式：①质粒，由细胞RNA聚合酶体内转录成复制子RNA；②裸RNA；③病毒颗粒，这种带有病毒样颗粒的复制子RNA在非互补细胞中由于缺乏病毒的结构蛋白，其基因虽然可以复制，但不能包装产生感染性子代，是一种包装缺陷型病毒。

1.资料与方法

1.1 材料

Vero及293T细胞购自于美国ATCC；常用的细胞培养试剂及耗材购买于某公司；常用的分子生物学操作试剂盒购买于北京某公司；RT-PCR扩增酶，荧光定量PCR检测试剂盒等购买于大连某科技有限公司；常用的限制性内切酶，T4DNA连接酶购买于某公司；HRP-羊抗兔IgG，EV71 VP2多克隆抗体购自深圳某公司；嘌呤霉素购自某公司。

1.2 研究方法

1.2.1 重组慢病毒载体的构建 根据EV71-08-02 (GenBank：FJ360545)的基因序列设计一对扩增EV71 VP4-VP2-VP3的引物。

FVP4-2-3：5'-CGACGCGTATGGGTTCGCAAGTGTCTACACAGC-3'

RVP4-2-3：5'-ATTTGCGGCCGCCTGGATGGTGCCCGTCTGCA-3'

上下游划线处分别为MluI以及NotI限制性内切酶识别位点。

按照分子生物学的方法扩增目的基因及克隆至慢病毒载体pLV-puro，构建pLV-EV71 VP4-VP2-VP3。

1.2.2 重组慢病毒包装及细胞感染 首先将pLV-EV71 VP4-VP2-VP3质粒及辅助质粒pH1和pH2转染到293T细胞中获得重组慢病毒，不含有目的片段的空载体为对照并命名为NC组。

其次将构建好的慢病毒感染Vero细胞，使用10μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳转细胞系，使用荧光显微镜观察细胞状态。

1.2.3 稳定转细胞系的荧光定量PCR检测 根据EV71 VP4-VP2-VP3的序列设计荧光定量PCR检测引物，引物序列为：

qfEV71：5'-TGGCATCCCAATATCACAGT-3'；

qrEV71：5'-GGTTCAAGGCAGAATCAAA-3'

提取细胞总RNA并计算1 μg总RNA需要的体积，使用反转录试剂盒反转录为cDNA。使用qPCR试剂盒以及荧光定量PCR检测引物对cDNA进行荧光定量检测。

1.2.4 稳转细胞系的Western Blot鉴定 使用5×蛋白上样缓冲液处理蛋白后进行SDS-PAGE电泳，将电泳后的凝胶上的蛋白转移至PVDF膜。分别使用EV71 VP2以及HRP-羊抗兔IgG作为一抗及二抗反应液进行检测，使用DAB显色试剂盒显色。

2.结果

2.1 重组慢病毒质粒的构建

FVP4-2-3，RVP4-2-3引物对EV71 RNA进行RT-PCR扩增，获得EV71 VP4-VP2-VP3基因片段。结果表明在1700 bp左右呈现特异性条带。结果如图1所示。

图1 EV71 VP4-VP2-VP3基因PCR扩增结果

2.2 表达EV71 VP4-VP2-VP3蛋白的稳转细胞系构建结果

分别对稳转细胞进行qPCR及Western Blot检测。经过筛选的细胞培养48h后观察细胞的形态如图2所示，qPCR检测实验结果表明表达EV71 VP4-VP2-VP3的Vero细胞的基因拷贝数显著高于其他两组，结果如图3所示。Western Blot检测结果表明，EV71 VP4-VP2-VP3在Vero细胞内获得表达结果如图4所示。

图2 细胞形态图

图3 荧光定量PCR检测结果

图4 Western Blot检测结果

3.讨论

HFMD长期危害儿童的健康[8]。虽然已有EV71灭活疫苗用于防控HFMD，然而灭活疫苗存在许多缺点。弱毒疫苗虽然具有良好的免疫原性，然而有关EV71相关毒力基因的研究还需要进一步的解决。近些年假病毒包装体系的建立为研发安全、有效的疫苗提供新思路。有关肠道病毒假病毒系统的研究还未见报道，这可能与缺乏相应互补细胞系的研究有关。

本研究基于EV71病毒的分子结构，将EV71的部分衣壳蛋白基因VP4-VP2-VP3克隆至慢病毒表达载体，通过感染的方法构建稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3的Vero细胞系。有研究表明EV71的主要毒力基因位点位于其基因组的非编码区[9]，而EV71的主要抗原片段或中和抗原表位则主要位于VP1蛋白[10]。因此本研究所构建的稳转细胞系从理论上并无致病性。稳转细胞系的图片验证了这设想。

4.结论

本研究成功构建了表达EV71 VP4-VP2-VP3的慢病毒表达系统，通过筛选获得了一株能够稳定表达EV71 VP4-VP2-VP3基因的Vero细胞株，为将来研制EV71新型疫苗奠定基础。