蕨麻地上部分多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

石子林 李军乔 王雅琼 董浩 牛永昆 李晨芹

摘要：通过优化蕨麻地上部分多糖提取工艺，为蕨麻地上部分的综合利用提供试验依据。本研究以蕨麻地上部分多糖提取率为评估指标，以液料比、提取温度、提取时间为影响因素，在单因素试验基础上结合响应面法优化蕨麻地上部分多糖提取工艺，并采用2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除法以及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除法测定其抗氧化活性。最佳提取工艺条件为：液料比41∶1（ml/g），提取温度80 ℃，提取时间97 min，提取率为2.68%。在最佳提取工艺条件下，多糖对DPPH自由基、ABTS自由基的半抑制质量浓度分别为0.76 mg/ml、0.64 mg/ml。本研究采用响应面法得到蕨麻地上部分多糖的最佳提取工艺，该工艺简便可行，提取的多糖具有较强的抗氧化活性。

关键词：蕨麻;多糖;响应面法;提取工艺;抗氧化活性

中图分类号：S566.9文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）03-0720-07

Optimization on the extraction process of polysaccharide from the aerial part of Potentilla anserina L. and its antioxidant activity

SHI Zi-lin1，2，3，LI Jun-qiao1，2，3，WANG Ya-qiong1，2，3，DONG Hao1，2，3，NIU Yong-kun1，2，3，LI Chen-qin1，2，3

（1.Tibetan Plateau Juema Research Centre， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China;2.Qinghai Provincial Biotechnology and Analytical Test Key Laboratory， Xining 810000， China;3.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai University for Nationalities， Xining 810000， China）

Abstract：To provide experimental basis for comprehensive utilization of the aerial parts of Potentilla anserina L.， the extraction process of polysaccharide was optimized. In this study， the yield of polysaccharide was used as the evaluation index， and the liquid-solid ratio， extraction time and extraction temperature were taken as influencing factors. The extraction process was optimized by response surface methodology on the basis of single factor test. The antioxidant activity of polysaccharide was determined by 2， 2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ABTS） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） radicals scavenging methods. The optimum extraction conditions were as follows： liquid-solid ratio 41∶1（ml/g）， extraction temperature 80 ℃， extraction time 97 min. Under the above conditions， the yield of polysaccharide was 2.68%. Under the optimum extraction conditions， the half-inhibiting concentrations of DPPH and ABTS were 0.76 mg/ml and 0.64 mg/ml， respectively. In this study， the optimum extraction process of polysaccharide from the aerial parts of Potentilla anserina L. obtained by response surface method is convenient and feasible， and the polysaccharide has strong antioxidant activity.

Key words：Potentilla anserina L.;polysaccharide;response surface method;extraction process;antioxidant activity

蕨麻是鵝绒委陵菜（Potentilla anserina L.）的变种，为蔷薇科（Rosaceae）委陵菜属（Potentilla L.），多年生草本[1]，鹅绒委陵菜广泛分布于中国华北、东北、西北、西南等地区，生长在海拔500～4 100 m的路边、河岸、山坡以及高寒草甸上[2]。在青藏高原等高寒地区因其根部较为膨大，故而称之为蕨麻，其中尤以青海省的分布区域最广，储量最高，品质最好[3]。

蕨麻在民间为药食两用的植物，已有约1 200年的历史。有研究结果表明，蕨麻地下部分具有抗缺氧[4-5]、抗氧化[6-7]、抑菌[8]以及保肝护肝[9-10]等作用，在食品、化妆品、保健品等行业具有较大的利用价值。汪境成等[11]研究发现，蕨麻地上部分富含黄酮、香豆素、生物碱、鞣质、多糖和三萜等，地下部分富含黄酮、香豆素、多糖、皂苷等。

多糖是一类由糖苷键结合，结构较为复杂的生物活性物质，因其具有降血脂、抗菌、抗氧化、抗肿瘤以及增强免疫活性[12-13]等功效而备受国内外学者关注。王迦琦等[14]用水提醇沉法提取北虫草多糖，多糖提取率为7.94%。陆海勤等[15]用超声协同高压矩形脉冲电场对黄花菜的多糖进行提取，多糖提取率为10.03%。党金宁等[16]用乙醇/硫酸铵在水溶液中形成的双水相体系作为多糖提取剂，对蕨麻地下部分含有的多糖进行提取，多糖提取率为14.46%。高丹丹等[17]用水提醇沉法提取蕨麻地下部分多糖，并用Box-Behnken中心组合试验设计原理对工艺进行优化，得其多糖提取率为24.53%。

蕨麻地下部分因其丰富的多糖储量，而广受学者关注。目前，对蕨麻地下部分多糖的研究较为充分，而对蕨麻地上部分多糖的研究则较少。每到蕨麻收获季节，蕨麻的地上部分往往被搁置，由此造成了极大的资源浪费，综合开发利用蕨麻地上部分也逐渐被提上了日程。本试验拟以蕨麻采摘后的地上部分为材料，对其多糖提取率进行测定，并对提取的蕨麻多糖进行抗氧化活性研究，以期提高蕨麻的附加值，为进一步开发利用蕨麻地上部分提供科学依据。

1材料与方法

1.1主要材料

蕨麻地上部分于2019年11月采自青海省西宁市湟源县牧场村蕨麻种植基地，经青海民族大学生态环境与资源学院李军乔教授鉴定为蔷薇科委陵菜属植物蕨麻。1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、D-无水葡萄糖、维生素C均购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%，其余试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

本试验所用仪器有：Neofuge23R台式高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司产品）、XFB-400高速中草药粉碎机（吉首市中诚制药机械厂产品）、EPED-20TH实验室级超纯水器（南京易普易达科技发展有限公司产品）、仪表恒温水浴锅（龙口市电炉制造厂产品）、UV-5500型紫外-可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司产品）、移液枪（Eppendorf公司产品）、HZQ-X160恒温振荡培养箱（苏州培英实验设备有限公司产品）。

1.3材料预处理

将采收的蕨麻地上部分自然风干至恒质量，粉碎后过60目筛，将过筛后的蕨麻地上部分用索氏提取法加20倍的石油醚进行回流提取6 h，除去石油醚后，将蕨麻地上部分粉末自然风干，备用。

1.4提取方法

精密称取1 g蕨麻地上部分粉末，以纯水作溶剂，按一定液料比，在一定温度下提取一定时间后，抽滤，取抽滤后的滤液进行浓缩，并定容至20 ml。用Sevage法脱蛋白质：向溶液中加入5 ml Sevage试剂（三氯甲烷∶正丁醇=4∶1，体积比），在恒温振荡培养箱（25 ℃、150 r/min）中反应15 min，再于高速冷冻离心机中离心（25 ℃、11 000 r/min）15 min，重复上述过程5～8次，直至蛋白质脱尽。取上清液，并添加4倍体积的无水乙醇，在4 ℃下静置过夜，离心（4 ℃、11 000 r/min）15 min，将所得沉淀依次用丙酮、无水乙醇洗涤后冻干，获得蕨麻地上部分多糖粗提物。

1.5葡萄糖标准曲线的制作

精密称量5 mg干燥至恒质量的葡萄糖标准品，置于50 ml容量瓶中，純水定容，得0.1 mg/ml葡萄糖标准溶液，分别吸取0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml、2.5 ml葡萄糖标准溶液于试管中，并依次滴加1.0 ml 5%苯酚、1.0 ml纯水和5.0 ml浓硫酸，定容至10.0 ml，摇匀，置于沸水浴中反应15 min后取出，冷却至室温，并于490 nm波长下测其吸光度（A），纯水作空白对照。以多糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程为：Y=51.296 0x+0.006 2（R2=0.999 4），多糖质量浓度为0.05～0.25 mg/ml时，线性关系良好。

1.6多糖质量浓度的测定

精密称取5 mg多糖粗提物，置于25 ml容量瓶中，纯水定容，获得待测液。取1 ml待测液于试管中，按照方法1.5中的方法进行显色并测其吸光度，结合标准曲线获得待测液中的多糖质量浓度，并计算其提取率。多糖提取率=（多糖质量/蕨麻地上部分粉末质量）×100%。

1.7蕨麻地上部分多糖提取工艺单因素试验

按方法1.4的提取方法，研究液料比、提取温度、提取时间3个因素对蕨麻地上部分多糖提取率的影响。

1.7.1液料比称取1 g蕨麻地上部分粉末，固定提取温度70 ℃，提取时间90 min，考察不同液料比[20∶1（ml/g）、30∶1（ml/g）、40∶1（ml/g）、50∶1（ml/g）、60∶1（ml/g）]对蕨麻地上部分多糖提取率的影响。

1.7.2提取温度称取1 g蕨麻地上部分粉末，固定液料比40∶1（ml/g），提取时间90 min，考察不同提取温度（50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）对蕨麻地上部分多糖提取率的影响。

1.7.3提取时间称取1 g蕨麻地上部分粉末，固定液料比40∶1（ml/g），提取温度80 ℃，考察不同提取时间（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min）对蕨麻地上部分多糖提取率的影响。

1.8蕨麻地上部分多糖提取工艺的响应面法优化

在上述单因素试验的基础上，根据Box-Benhnken响应面法试验设计原理，选取液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）为影响因素，以蕨麻地上部分多糖提取率为响应值（Y），采取3因素3水平试验，确定最佳提取工艺。试验因素设计水平如表1显示。

1.9蕨麻地上部分多糖抗氧化性试验

1.9.1DPPH自由基清除试验

将最优条件下提取的蕨麻地上部分多糖配制成质量浓度为0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml、1.8 mg/ml的试液，同时配制0.04 mg/ml的DPPH溶液。分别取不同质量浓度的蕨麻地上部分多糖溶液各0.5 ml于试管中，滴加1.5 ml无水乙醇，再滴加2.0 ml DPPH溶液，摇匀，避光静置反应30 min，于517 nm处测其吸光度，得样品组清除率。对照组用0.5 ml超纯水代替多糖溶液，空白组则用2.0 ml无水乙醇代替DPPH溶液。以VC为阳性对照，按上述方法进行操作。清除率计算公式如下：

清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%

A0：空白组吸光度，A1：样品组吸光度，A2：对照组吸光度。

1.9.2ABTS自由基清除试验将最优条件下提取的蕨麻地上部分多糖配制成质量浓度为0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml、0.8 mg/ml、1.0 mg/ml、1.2 mg/ml、1.4 mg/ml、1.6 mg/ml、1.8 mg/ml的試液，用2.45 mmol/L的过硫酸钾将ABTS配制成7.00 mmol/L的储备液，避光静置过夜后用超纯水将其稀释至λ734=0.70±0.02，得ABTS·+工作液。精密吸取各质量浓度的蕨麻地上部分多糖溶液0.1 ml于试管中，滴加3.9 ml ABTS·+工作液，摇匀，避光静置反应30 min后于734 nm处测其吸光度，得样品组清除率。对照组用0.1 ml超纯水代替多糖溶液，空白组则用3.9 ml无水乙醇代替ABTS·+工作液。以VC为阳性对照，按上述方法进行操作。

2结果与分析

2.1蕨麻地上部分多糖提取工艺单因素试验结果

2.1.1液料比

图1显示，蕨麻地上部分多糖提取率随液料比的增大而呈现先增大后减小的趋势，当液料比达到40∶1（ml/g）时，提取率达到最大值，此时的提取率为2.13%。因此，选择蕨麻地上部分多糖提取工艺的最佳液料比为40∶1（ml/g）。

2.1.2提取温度

结果（图1）表明，蕨麻地上部分多糖提取率随提取温度的增大而呈现先增大后减小的趋势，当提取温度达到80 ℃时，提取率达到最大值，此时的提取率为2.58%。因此，选择蕨麻地上部分多糖提取工艺的最佳提取温度为80 ℃。

2.1.3提取时间

蕨麻地上部分多糖提取率随提取时间的增大而呈现先增大后减小的趋势，当提取时间达到90 min时，提取率达到最大值，此时的提取率为2.74%（图1）。因此，选择蕨麻地上部分多糖提取工艺的最佳提取时间为90 min。

2.2蕨麻地上部分多糖提取工艺响应面法优化试验结果

根据Box-Behnken响应面法试验设计原理，设计3因素3水平试验，探究液料比、提取时间、提取温度3因素相互作用对蕨麻地上部分多糖提取率的影响，试验设计方案如表2显示。利用Design-Expert 8.0.6软件对表2中17组试验数据进行回归统计分析，得到回归方程为：

Y=-15.189 800+0.490 300A+0.164 300B+0.027 100C+0.000 525AB+0.000 167AC+0.000 058BC-0.006 680A2-0.001 205B2-0.000 198C2

Y：多糖提取率;A：液料比;B：提取温度;C：提取时间。

表3显示，回归模型整体的P<0.000 1，可信度水平大于99.999%，说明该模型具有高度的显著性。一次项A、C以及二次项A2、B2、C2均具有显著影响，并且其差异具有统计学意义（P<0.010 0）。A、B、C三因素交互项的显著性较差，说明试验因素与响应值是一种非线性关系。回归方程的R2=0.988 2，说明此模型与本试验具有良好的拟合性。R2adj=0.973 1，说明该模型可解释97.31%响应值的变化。失拟项P=0.135 6>0.050 0，失拟项差异不显著，说明差异无统计学意义，试验误差较小，操作可信度较高，因而可用该模型来确定最佳的提取工艺。此外，由F值可看出，3个因素对蕨麻地上部分多糖提取率的影响表现为：液料比>提取时间>提取温度。

为了更直观地看出各因素对蕨麻地上部分多糖提取率的影响，绘制了三维响应面图，试验因素对蕨麻地上部分多糖提取率的影响越显著，响应面的坡度越陡峭，反之则较为缓和。

A：液料比;B：提取温度;C：提取时间。

图2显示，当液料比为30∶1～40∶1（ml/g），提取温度为70～80 ℃时，蕨麻地上部分多糖提取率随着因素水平的提升而增加，之后提取率随着各因素水平的继续增加而降低，并且液料比曲线较提取温度曲线更为陡峭，说明液料比对多糖提取率的影响高于提取温度。

图3显示，当液料比为30∶1～42∶1（ml/g），提取时间为60～95 min时，蕨麻地上部分多糖提取率随着因素水平的增加而增加，之后提取率随着各因素水平的继续增加而降低，并且液料比曲线较提取时间曲线更为陡峭，说明液料比对多糖提取率的影响高于提取时间。

图4显示，当提取温度为70～82 ℃，提取时间为60～95 min时，蕨麻地上部分多糖提取率随着因素水平的增加而增加，之后提取率随着各因素水平的继续增加而降低，并且提取时间曲线较提取温度曲线更为陡峭，说明提取时间对多糖提取率的影响高于提取温度。

综上，各因素对蕨麻地上部分多糖提取率的影响表现为：液料比>提取时间>提取温度，与表3结论相符。

经响应面法优化后，所得的最佳提取工艺为：液料比41.04∶1.00（ml/g），提取温度79.47 ℃，提取时间97.61 min，此时蕨麻地上部分多糖的提取率为2.72%。考虑到实际操作的简便性，选取液料比为41.00∶1.00（ml/g），提取温度80.00 ℃，提取时间97.00 min，在此条件下进行3次平行试验，多糖提取率平均值为2.68%。试验结果表明，蕨麻地上部分多糖提取率与回归方程预测值2.72%相近，该模型可较好地预测各因素与多糖提取率之间的关系，同时也证明了蕨麻地上部分多糖提取工艺的稳定性及可行性。

2.3蕨麻地上部分多糖抗氧化性

2.3.1DPPH自由基清除率图5显示，蕨麻地上部分多糖具有清除DPPH自由基的能力，并且其清除能力随着多糖质量浓度的增高而增高，多糖质量浓度为1.40 mg/ml时，DPPH自由基清除率可达74.15%，之后随多糖质量浓度继续增加，DPPH自由基清除率变化缓慢。半抑制质量浓度（IC50）为0.76 mg/ml。

2.3.2ABTS自由基清除率

图6显示，蕨麻地上部分多糖具有清除ABTS自由基的能力，其清除能力随着多糖质量浓度的增高而增高，多糖质量浓度为1.20 mg/ml时，ABTS自由基清除率可达61.65%，之后随多糖质量浓度继续增加，ABTS自由基清除率变化缓慢。IC50为0.64 mg/ml。

3结论

目前，对植物多糖的提取主要有加热回流法、酶辅助提取法以及超声波辅助提取法等[18-20]。由于加热回流法较为简便，多糖提取率也较高，因此本试验采用加热回流法对蕨麻地上部分多糖提取工艺进行探究。不同提取条件对多糖提取率的影响不同，通常需要优化工艺条件来提高多糖提取率。Box-Behnken响应面法是中药材提取工艺优化中一种较为常用的方法，此法结合数学和统计学，对各个因素进行多重回归分析，得到回归拟合方程，模型预测性较好，与传统的正交试验法相比，更能反映各因素各水平之间的相互关系，在工艺优化等领域受广大学者青睐。

本试验通过单因素法确定各因素的取值范围，并在此基础上结合响应面法对提取工艺进行优化。结果表明，该模型能较好地预测各因素与蕨麻地上部分多糖提取率之间的关系，可靠性较高，并结合ABTS自由基清除法、DPPH自由基清除法测定了蕨麻地上部分多糖的抗氧化性能，对蕨麻地上部分后续研究具有指导意义。

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（责任编辑：王妮）