中空纤维超滤技术在死后溶血血液总IgE检测中的应用

王天琦，贾宇晴，刘添翼，刘逸凡，曹志鹏，朱宝利

（1.中国医科大学法医学院法医病理学教研室，辽宁 沈阳 110122；2.中国医科大学临床三系，辽宁 沈阳110122）

过敏性休克（anaphylactic shock）是由药物、食物等致敏原引起的全身超敏反应，主要以Ⅰ型超敏反应为主。在法医学实践中，过敏性休克死亡案例较为常见，且由于缺乏特征性病理形态学变化，是法医病理学鉴定中的一大难题[1]。IgE作为介导Ⅰ型超敏反应的关键介质，已有报道[2-3]其血清检测值可用于法医学过敏性休克案例的辅助诊断。然而，由于我国尸体以冷冻保存为主，在法医学实践中，血液受溶血干扰严重无法分离血清。在临床研究中，溶血对多项检测指标均存在重大干扰[4-6]，而实际情况中死后检材的溶血程度远比临床样本严重，特别是我国大多数死后尸体因冷冻保存而产生的重度溶血，使得常规方法检测总IgE的结果失去了可信价值。因此，建立有效的溶血样本IgE检测的前处理方法、推测溶血前血清总IgE浓度对过敏性休克死亡的法医学鉴定具有重要意义。

超滤（ultrafiltration）是指应用固定孔径的超滤膜通过膜两侧压力不同对液体中不同分子量大小的物质进行分离、纯化的技术，在工业净水及废水处理、蛋白质的分离纯化中得到广泛应用[7-8]。本研究选用适当孔径的切向流超滤膜柱对溶血样本进行超滤处理，探究超滤技术能否对溶血样本进行有效处理，并探究超滤液中IgE的浓度是否能还原至溶血前血清浓度。

1 材料与方法

1.1 样本

本研究选取33例中国医科大学法医司法鉴定中心在2016—2018年间所受理的非冷冻尸体解剖案例（非过敏性死亡）心血样本（表1），每例取4 mL血液，其中1mL用Z323K高速离心机（德国HERMLE公司）以3000×g[9]，离心20min，获得血清，-80℃保存备检。由于血浆样品中脂质对多项指标检测会造成影响，采用Z323K高速离心机（德国HERMLE公司）以12 000×g，离心 5 min，去除脂质对检测的影响[10]。余3 mL血液-20℃冷冻24 h，室温下30 min使其完全融化，反复3～5次，制备全溶血样品，于-80℃保存备检。

本研究通过了中国医科大学伦理委员会的批准。

表1 33例非冷冻尸体心血样品Tab.1 The 33 heart blood samples of non-frozen corpses

1.2 超滤装置及处理过程

选取中空纤维超滤组件（MicroKros®，mPES，截留相对分子质量100000，20cm2，美国Spectrum Laboratories公司），以生理盐水为稀释基质对全溶血样品进行超滤处理，具体过程如下。

超滤装置的组装：通过两通、三通连接器将中空纤维超滤组件和4个注射器如图1所示组装。其中，1号、2号注射器作为超滤血样使用，3号注射器作为添加生理盐水使用，4号注射器作为抽取废弃液体使用。

图1 中空纤维超滤装置示意图Fig.1 Schematic diagram of hollow fiber ultrafiltration device

超滤处理过程：

（1）使用1号注射器抽取2mL全溶血样品，调整三通连接器，关闭3号注射器，缓慢推动1号注射器至整个中空纤维超滤组件内芯充满样品，记下此时1号注射器体积。此时，2号注射器内会存在部分气体，排空2号注射器后重新将其连接至装置上。

（2）调整三通连接器，关闭1号注射器、打开3号注射器，向超滤组件中推注适量生理盐水后关闭3号注射器、打开1号注射器，反复推动1号、2号注射器对超滤组件中液体进行超滤，使用4号注射器抽取外管废液并弃去。

（3）重复上步操作至外管废液几乎无色，此时调整内芯滤液体积至2号注射器排空时1号注射器内液体体积与（1）操作中所记录的体积相同，保留内芯液体，用Z323K高速离心机以12 000×g，离心5 min，保留上清液（即超滤液）-80℃保存备检。

1.3 血红蛋白、总IgE的检测

应用文齐氏液（天津市现代高新技术研究院中山研究所）在UV-1800紫外-分光光度计（日本岛津公司）对血清、全溶血样品及其超滤液中血红蛋白进行检测（氰化高铁血红蛋白法）。超滤液、血清中总IgE应用Cobas e411电化学发光全自动免疫分析仪（瑞士Roche公司）及配套人免疫球蛋白E检测试剂盒（瑞士Roche公司）进行检测。由于试剂盒要求血红蛋白质量浓度小于1g/L，因此依据血红蛋白检测结果，将存在溶血的血清使用生理盐水稀释2～3倍使其符合检测要求。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 20.0软件（美国IBM公司），利用线性回归对超滤液及对应血清IgE检测值进行回归分析并计算相关系数。超滤液校正后IgE含量与对应血清IgE检测值以及全溶血样品与超滤液血红蛋白含量的比较分析采用Wilcoxon符号秩和检验。根据TRAN等[11]IgE血清参考值，以＞60U/mL为阳性，应用四格表χ2检验比较血清与超滤液校正值的阳性率。双侧检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 超滤液与血清中总IgE含量的相关性与回归分析

对33例样品超滤液与对应血清中总IgE浓度进行相关性，结果可见，超滤液中IgE检测值（x）与血清中总IgE浓度（y）有强相关性（r=0.984），并通过回归分析得出两者的回归方程（图2）：

图2 超滤液与血清总IgE检测值线性回归图Fig.2 Linear regression plot of total IgE detection value between ultrafiltrate and serum

2.2 血清、全溶血样品及其超滤液中血红蛋白和IgE含量的比较分析

血清、全溶血样品及其超滤液的血红蛋白浓度及血清、超滤液及超滤液回归校正的总IgE检测值见表2。超滤后滤液呈淡红色，比超滤前全溶血样品颜色浅淡、清亮。超滤液中血红蛋白浓度远小于全溶血样品，两者间差异有统计学意义（P＜0.05）。将超滤液的检测值通过回归方程校正后与血清中总IgE浓度进行比较，两者间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 血红蛋白质量浓度和IgE含量Tab.2 Hemoglobin concentration and IgE content（n=33）

2.3 血清与超滤液回归校正值的阳性率比较

应用χ2检验对血清与超滤液校正值的检测阳性率进行比较（表3）得出，血清与超滤液校正值检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 血清与超滤液校正值的IgE阳性率Tab.3 The positive rate of IgE in serum and ultrafiltrate

3 讨 论

溶血对多项生化指标检测具有重大影响[5-6]，米丽等[12]的研究也证实随着溶血程度增加，ELISA法检测总IgE的干扰也随之增加，究其原因，包括血细胞破裂后对血清造成的稀释作用、血细胞内容物释放后对检测产生干扰及大量血红蛋白造成的颜色干扰等[13]。在死后样品总IgE检测中，由于溶血常常导致无法分离获得血清，虽然在近年研究中已证实心包液可作为血清替代检材进行总IgE检测[11]，但心包液不是经常可以获取。因此，探究溶血样品前处理方法，建立死后溶血样品IgE检测的解决对策仍是法医学实践中亟待解决的实际问题。

由于IgE的相对分子质量为196000，因此本研究选用截留相对分子质量为100000的中空纤维超滤膜柱，不仅能截留住大分子量的IgE，还能有效去除产生颜色干扰的血红蛋白（相对分子质量64 000）及其他小分子量杂质。本研究结果显示，虽然中空纤维超滤处理不能彻底去除血红蛋白，但通过超滤处理后大部分血红蛋白被过滤（2.24～27.71 g/L），与全血（23.34～223.32g/L）相比差异具有统计学意义，说明超滤对溶血样品具有良好的处理效果，同时也使样品更接近试剂盒检测要求（＜1g/L），极大地减少了溶血对检测造成的影响。在总IgE检测方面，将样品进行超滤处理后发现，超滤液IgE检测值与血清IgE检测值之间具有良好的相关性（r=0.984），并将超滤检测值通过回归方程校正后发现，超滤液校正值与血清检测值之间差异无统计学意义，χ2检验证实超滤液校正值仅有1例假阴性，二者检测阳性率差异无统计学意义，说明超滤处理并校正后的检测值及检测阳性率接近溶血前血清水平。但本研究也有一定局限性，实验所选33例非冷冻尸体心血样品，均为非过敏死亡，但并未对是否存在过敏性疾病做详细调查，推测在这33例中存在生前患有过敏性疾病的死者，因此血清IgE检测值较为分散（3.53～647.2U/mL），但校正后结果均接近血清水平，说明超滤处理的方法有初步的实际意义。

综上所述，超滤技术既可去除大量溶血杂质又能很大程度上还原溶血前血清总IgE水平，在溶血样品总IgE检测中具有实用价值，同时也为溶血后其他大分子量蛋白检测提供一个新的可行性方案，也为法医学中冷冻尸体溶血样品总IgE检测提供了新的方向。