色谱-质谱联用技术鉴定盐酸咪达唑仑的有关物质

金 瑞，闫若凝，陆宇婷，宋 敏，杭太俊

（中国药科大学药物分析系，南京210009）

盐酸咪达唑仑（1-甲基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并［l，5-a］［l，4］苯并二氮杂䓬盐酸盐，midazolam hydrochloride，图1）是一种短效苯二氮䓬类药物（GABA-a 激动剂），对中枢神经系统有抑制作用，起效快，不良反应少［1-5］，可用于镇静催眠、抗惊厥及麻醉诱导［6-7］。目前，文献报道主要集中在临床应用和药理学研究［6-9］。咪达唑仑有关物质研究虽已有报道［10-13］，主要阐述了咪达唑仑有关物质分析方法的建立及验证［10］，针对工艺杂质、降解杂质的鉴定和裂解机制的研究［11-13］尚不完善。

本研究建立了适用于盐酸咪达唑仑全部有关物质（工艺杂质及降解产物）检查的LC-MS 方法，通过光谱检测和分析、对照品比对、并结合合成工艺（图1），共分析鉴定了成品中潜在的22个有关物质，其中包括中间体、副产物及分降解产物（图2），可为盐酸咪达唑仑的贮存条件制定，生产工艺和质量控制提供参考依据。

Figure 1 Typical synthetic routes of midazolam hydrochloride

1 材 料

1.1 试 剂

盐酸咪达唑仑及其有关物质对照品（中国食品药品检定研究院及USP 对照品）；乙酸铵、冰醋酸（AR 级，南京化学试剂有限公司）；乙腈（CR 级，美国Tedia 公司），市售超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪 器

岛津LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪、Lab-Solutions 数据处理系统（日本岛津公司）；BS21S分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方 法

色谱条件：Thermo BDS HYPERSIL C18（100 mm × 4.6 mm，2.4 μm）色谱柱；流动相A 相为25 mmol/L 乙酸铵缓冲溶液（用冰醋酸调节pH 至5.5），B 相为乙腈，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（75∶25）→20 min（50∶50）→25 min（50∶50）→26 min（75∶25）→32 min（75∶25），流速0.65 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。

质谱条件：电喷雾正离子化，高分辨Q-TOF/MS 测定，NaI 溶液（400 μg/mL）准确质量校正。喷雾电压4.0 kV，雾化气压力230 kPa，流量3 L/min，接口温度300 ℃，加热气流量10 L/min，干燥气流量10 L/min，氩气CID 碰撞能量30～40 eV，扫描范围m/z50～1 000。

供试品溶液：取盐酸咪达唑仑约5 mg，精密称定，置于5 mL量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1 mg/mL 的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加25%乙腈定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。

混合对照品溶液：取各有关物质对照品（有关物质5、6、8、10、13、16、17、18、19、21 和22）适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释成质量浓度均约为1 μg/mL的溶液，作为混合杂质对照溶液。

强制降解试验溶液：取盐酸咪达唑仑约5 mg，加0.01 mol/L 盐酸溶液0.2 mL，60 ℃水浴放置10 min，或加0.01 mol/L 氢氧化钠溶液0.2 mL，60 ℃水浴放置10 min，或加30%过氧化氢1 mL，60 ℃水浴放置10 h，或加25%乙腈1 mL，90 ℃水浴放置6 d，或加25%乙腈1 mL 光照（4 500 lx）放置2 d，或110 ℃烘箱中放置10 d，或光照（4 500 lx）放置10 d，分别处理后，各加25%乙腈溶解（酸碱处理样品先中和）并稀释至5 mL，配制成质量浓度均约为1 mg/mL 的强制降解试验溶液。同时进行空白溶剂试验。

3 结 果

3.1 有关物质检查

美国药典（USP 43）中采用乙腈-100 mmol/L 醋酸盐缓冲溶液等度洗脱［14］的反相HPLC 方法检查咪达唑仑的有关物质。该条件下潜在有关物质之间的分离差异较大，耗时较长。

本研究优化了缓冲溶液浓度，并使用梯度洗脱方法进行盐酸咪达唑仑中有关物质的分离与检查。结果：显著改善了盐酸咪达唑仑各有关物质的分离度，提高了分析效率，并适用于有关物质的LC-MS鉴定。

根据工艺过程、潜在副产物分析［13，15］，结合强制降解试验，分离检测到盐酸咪达唑仑中潜在的22个主要有关物质（图2），对各杂质依保留时间从小到大顺序编号。其中8 个为工艺杂质：5、6、8、11、13、17、18 和19；11 个为降解产生：1、2、4、7、9、12、14、15、16、20 和22；3 个既是工艺杂质又是降解杂质：3、10、21。并且有关物质：5、6、8、10、13、17、18 和21 分别与USP 43 规定的已知有关物质A、C、B、D、E、F、G和H相对应。

采用0.1%主成分自身对照法估算杂质的含量，盐酸咪达唑仑原料药中仅检测到1个有关物质（3）的含量大于0.1%。

强制降解试验结果表明（表1），盐酸咪达唑仑在酸、碱破坏条件下，有关物质3的含量显著增大，并新增1 个明显降解产物（有关物质16）。在高温干法条件下，未见明显降解产物；在高温湿法破坏条件下，产生4 个主要降解产物（有关物质7、15、16、21）。在干法光照条件下，新增1个明显降解产物（有关物质4）；在湿法光照破坏条件下，产生6个主要降解产物（有关物质2、7、12、14、16、22）。在氧化破坏条件下，产生9 个主要降解产物（有关物质1、2、4、7、9、10、14、20、22）。

Table 1 Material balance of the stressed samples of midazolam hydrochloride

3.2 有关物质鉴定

采用Q-TOF/MS 高分辨测定各有关物质的母离子及子离子的准确质量和元素组成，并通过合成工艺路线及反应机制的分析，推定各主要有关物质的结构；主要工艺杂质（3、5、6、8、10、11、13、17、18、19和21），均进一步通过制备和对照品比对确证。结果见表2、图3和图4。

Figure 2 HPLC-UV chromatograms of midazolam hydrochloridea:Blank; b:Reference 0.1%; c:Active pharmaceutical ingredients(API)and its stressed solutions (d:Acid; e:Alkaline; f:Oxidation; g:Wet thermal;h:Dry thermal;i:Wet photolysis;j:Dry photolysis);k:Impurity references mixture;l:Impurity 11 reference

ESI-Q-TOF/MS 测得咪达唑仑［M+H］+的准确质量为326.085 54，与离子式C18H14ClFN相应；其主要特 征 碎 片 离 子（图5）m/z291.120 3（C18H14FN）249.085 0（C16H10FN）、244.035 7（C14H8ClFN+）、223.081 3（C15H10FN+·）和209.065 2（C14H8FN+·），分别是［M+H］+脱去一个Cl 原子、同时脱氯与咪唑环裂解脱乙烯亚胺（CH2=C=NH）、脱2-甲基咪唑基、脱氯并七元杂环开环重排、或同时脱氯与2-甲基咪唑基单元产生。咪达唑仑的二级质谱和裂解途径分析对解析确证其有关物质结构具有参考意义。

3.2.1 工艺杂质的结构鉴定 根据合成工艺、潜在副产物分析［13，15］和对照品比对，确证鉴定各工艺有关物质的结构及其来源。

有关物质3是成品中存在的特征杂质，并且在强制降解的多个试验条件下极易产生，所以有关物质3 是咪达唑仑的关键工艺杂质和关键质量指标成分。ESI-Q-TOF/MS 测得有关物质3［M+H］+的准确质量344.095 83，与离子式C18H16ClFN3O+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多1分子水；据文献报道［16］，咪达唑仑制成盐酸盐时，处于酸性环境中，结构中亚胺基会发生可逆性水解开环，有关物质3 是该水解产物。其主要特征碎片（图6）离子m/z315.072 0 （C17H13ClFN2O+） 、 274.048 9（C15H10ClFNO+）和123.025 8（C7H4FO+）均与分子结构中含有二苯酮单元特征相应，分别与［M+H］+脱亚胺（CH2=NH）、咪唑环裂解乙烯亚胺（CH2=C=NH）、或二苯酮基断裂相应。确证有关物质3 是咪达唑仑结构中苯并二氮杂䓬环上亚胺基水解开环，而形成的二苯酮胺降解或工艺杂质。

Table 2 LC-MS characteristics of midazolam related substances

Figure 3 Chemical structures of midazolam related substances 1-22

有关物质10 主要在氧化破坏条件下产生，［M+H］+的 准 确 质 量342.080 49，与 离 子 式C18H14ClFN3O+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多一个O元素。MS及对照品比对确证鉴定有关物质10 为咪达唑仑的苯并二氮杂䓬环上亚胺的N 氧化副产物（USP 咪达唑仑杂质D），其二级质谱碎片离子（图7）均确证相应结构。

有关物质21 主要在高温湿法条件下产生，［M+H］+的准确质量为326.085 76，与离子式C18H14ClFN3+相应，与咪达唑仑相对分子质量一致，两者互为同分异构体。MS 及对照品比对确证鉴定有关物质21是咪达唑仑合成中七元杂环上双键位置异构的副产物（USP 咪达唑仑杂质H），其二级质谱碎片离子（图8）均确证相应结构。

有关物质5 和17［M+H］+的准确质量分别为328.101 91 和328.102 03，均与离子式C18H16ClFN3+相应，比咪达唑仑相对分子质量多2；有关物质8［M+H］+的准确质量为330.116 87，与离子式C18H18ClFN3+相应，比咪达唑仑相对分子质量多4；结合咪达唑仑合成工艺［15］，MS 及对照品比对确证鉴定。有关物质5 是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP 咪达唑仑杂质A），有关物质8和17 是咪达唑仑发生不同程度还原，而产生的副产物（USP咪达唑仑杂质B和F）。

Figure 4 MS/MS spectra of midazolam and its related substances[M+H]+ionsAPI(m/z 326);1(m/z 248);2(m/z 359);3(m/z 344);4(m/z 342);5(m/z 328);6(m/z 304);7(m/z 358);8(m/z 330);9(m/z 342);10(m/z 342);11(m/z 292);12(m/z 342);13(m/z 348);14(m/z 289);15(m/z 326);16(m/z 343);17(m/z 328);18(m/z 308);19(m/z 332);20(m/z 273);21(m/z 326);22(m/z 273)

Figure 5 Midazolam[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 6 RS 3[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 7 RS 10[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 8 RS 21[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质6［M+H］+的准确质量为304.101 13，与离子式C16H16ClFN3+相应，其碎片离子287.079 5（C16H13ClFN2+）比［M+H］+少17，与NH3相应；结合咪达唑仑合成工艺［15］，MS 及对照品比对，确证鉴定有关物质6 是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP咪达唑仑杂质C）。

有 关 物 质11［M+H］+的 准 确 质 量 为292.124 00，与离子式C18H15FN3+相应，与咪达唑仑元素组成相比，少1 个Cl元素，多1 个H 元素，其一级质谱结果中也未出现Cl 的同位素峰，说明该杂质与咪达唑仑结构中的Cl 被H 替代相应。MS 及对照品比对，确证鉴定有关物质11 为咪达唑仑的非氯代副产物。

有 关 物 质13［M+H］+的 准 确 质 量 为348.054 89，与离子式C16H12ClFN3O3+相应，与咪达唑仑元素组成相比，少两个C 元素，多3 个O 元素；其特征碎片m/z330.046 0（C16H10ClFN3O2+）、302.071 7（C16H12ClFN2O+·）、287.039 6（C15H9ClFN2O+），分别与［M+H］+离子丢失1 分子H2O、1 分子NO2和硝基亚甲基碎片相应；确证分子结构中含有硝基取代。结合咪达唑仑合成工艺［15］，MS 及对照品比对，确证有关物质13是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP 咪达唑仑杂质E）。

有 关 物 质18［M+H］+的 准 确 质 量 为308.096 07，与离子式C18H15ClN3+相应，与咪达唑仑元素组成相比，少1个F 元素多1个H 元素。MS及对照品比对，确证有关物质18 为咪达唑仑非氟代的副产物（USP咪达唑仑杂质G）。

有 关 物 质19［M+H］+的 准 确 质 量 为332.059 25，与离子式C16H12ClFN3O2+相应，与有关物质13元素组成相比，少一个O 元素；结合咪达唑仑合成工艺［15］，MS 及合成对照品比对，确证有关物质19是咪达唑仑合成过程中的中间体（图1）。

3.2.2 降解杂质的结构鉴定 通过有关物质HPLC 定位及质谱特征分析，测得各降解杂质母离子的准确质量和离子组成及它们的二级质谱特征碎片（图4），结合咪达唑仑裂解规律，对强制降解样品中产生的有关物质进行综合分析，鉴定它们的结构。

有关物质1 和2 是咪达唑仑的特征氧化降解杂质，反相色谱保留显著降低，表明极性显著增大。有关物质1［M+H］+的准确质量为248.058 91，与离子式C12H11ClN3O+相应，与咪达唑仑被氧化脱去2-氟苯基单元的羟基取代转化物相应；其主要特征碎片（图9）离子m/z219.035 8（C11H8ClN2O+）、178.006 0（C9H5ClNO+）和150.014 7（C8H5ClN+）分别与［M+H］+开环裂解脱去亚胺（CH2=NH）、进一步咪唑环裂解（CH2=C=NH）、或咪唑环和酰基亚胺（CHO-N=CH2）同时脱去相应，确证了该杂质结构中仍然保留了与咪达唑仑相应的咪唑环并苯并二氮杂䓬环基本结构特征。同时测得m/z138.997 1（C7H4ClO+）和111.002 4（C6H4Cl+）离子，它们进一步证明了咪达唑仑被氧化脱去2-氟苯基单元后，羟基取代亚胺转化成内酰胺的结构特征。

Figure 9 RS 1[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

有 关 物 质2 ［M+H］+的 准 确 质 量 为359.059 55，与离子式C18H13ClFN2O3+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多3O、少NH；其主要特征碎片（图10）离 子m/z315.071 6（C17H13ClFN2O+）、297.062 2（C17H11ClFN）和123.025 2（C7H4FO+）均与有关物质3的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元。又m/z315 离子与其［M+H］+脱去羧基单元相应。所以，鉴定有关物质2是咪达唑仑结构中苯并二氮杂䓬环上亚胺基发生水解开环、并氧化成羧酸，而生成的二苯酮类降解杂质。其极性明显增大，反相色谱保留显著减弱。

有关物质7也是氧化降解杂质，并在湿法加热和光照条件下产生，其［M+H］+的准确质量为358.075 49，与离子式C18H14FClN3O2+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多2 个O 元素；其主要特征碎片（图11）离 子m/z315.074 1（C17H13ClFN2O+）、297.060 0（C17H11ClFN）和123.025 5（C7H4FO+）均与有关物质3 的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元。又m/z315 离子与其［M+H］+脱去酰胺（O=C=NH）单元相应。所以，鉴定有关物质7 是咪达唑仑苯并二氮杂䓬环上亚胺基发生水解开环、并氧化成酰胺，而生成的二苯酮类降解杂质。

Figure 10 RS 2[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质4 和9 均主要为氧化降解杂质，有关物质12 主要在湿法光照条件下降解产生，三者［M+H］+的准确质量分别为342.080 08、342.081 55和342.080 78，均与离子式C18H14ClFN3O+相应，与咪达唑仑元素组成相比，均多一个O 元素，并都与咪达唑仑的氧化副产物10 互为同分异构体。所以，在咪达唑仑结构中，存在多个易被氧化降解的位点，潜在多种氧化产物结构，需要结合二级质谱区别确证。

有关物质4 的主要特征碎片离子（图12）m/z325.068 3（C18H11ClFN2O+）、311（C17H9ClFN2O+）、307.116 2（C18H14FN3O+·）、278.112 8（C17H13FN3+）和260.035 0（C14H8ClFNO+），分别与［M+H］+脱NH3、咪唑环断裂（NH2-CH3）、脱Cl 原子、脱1 分子HCl和羰基单元、或咪唑环断裂脱去相应。因此，鉴定有关物质4 为咪达唑仑的甲基与咪唑亚胺双键异构，并且氮杂䓬环的CH2被氧化而成的酰基亚胺化合物。

Figure 11 RS 7[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质9 的二级质谱图与有关物质4 相似，也有特征碎片离子m/z307.116 1（C18H14FN3O+·）、260（C14H8ClFNO+），推测二者具有类似的特征结构；但是，未见有关物质4 特有的与［M+H］+脱NH3和咪唑环断裂（NH2-CH3）碎片m/z325.068 3（C18H11ClFN2O+）和311（C17H9ClFN2O+）；所以，有关物质9 中的杂环氮均为叔胺状态，其特征碎片265.077 4（C16H10FN2O+）和225.061 6（C14H8FNO+·）分别与［M+H］+脱去一个Cl 原子且咪唑环断裂脱乙烯亚胺（CH2=C=NH）、或咪唑环与苯并二氮杂䓬环同时断裂特征相应。确证，有关物质9为咪达唑仑的咪唑环双键与氮杂䓬环异构后，再被氧化而成的酰基亚胺化合物（图12）。

有关物质12 的主要特征碎片离子（图12）m/z325.083 8（C18H11ClFN2O+）、297.060 4（C17H11ClFN2+）和262.092 4（C17H11FN2+·）分别与［M+H］+脱去NH3、脱去酰胺（O=CH-NH2）、或进一步脱去Cl 原子相应，表明结构中存在内酰胺结构，且易脱去NH3。所以鉴定有关物质12是咪达唑仑的甲基与咪唑亚胺双键异构和氮杂䓬的环亚胺的双键异构并羟基取代转化物（图12）。

有关物质14是光照湿法条件的特征杂质，也是氧化降解杂质，其［M+H］+的准确质量为289.054 47，与离子式C15H11FClN2O+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多1个O元素，少C3H3N；其主要特征碎片（图13）m/z261（C14H11ClFN2+·）和259（C14H9ClFN2+·）均与［M+H］+脱去羰基相应，226.093 2（C14H11FN2+·）与206.086 7（C14H10N）分别为m/z261 脱去一个Cl 原子、进一步脱去1 分子HF 而成。确证有关物质14 是咪达唑仑的咪唑环氧化开环脱去，形成内酰胺的降解杂质［13］。

有关物质15 是高温湿法降解杂质，其［M+H］+的准确质量326.085 55，与离子式C18H14N3FCl+相应，与咪达唑仑及有关物质21的元素组成一致，三者互为同分异构体，这与咪达唑仑母核中多个双键易发生双键位置异构的特征相应；有关物质15的特征碎片离子（图15）m/z297.062 2（C17H11FN2+）、243.100 5（C16H9N3+）和221.064 7（C15H8FN+·）分 别与［M+H］+脱亚胺（CH2=NH）、脱去Cl原子及1分子HF 并咪唑环裂解乙烯（CH2=CH2）、或同时脱氯且咪 唑 环 裂 解（CH=N-C（CH3）=NH）相 应；m/z221.064 7（C15H8FN+·）比咪达唑仑特征碎片离子223.081 3（C15H10FN+·）少2，说明有关物质15 是苯并二氮杂䓬环上为烯双键；除有关物质21 外咪达唑仑双键位置异构体还存在两种（图14），相对于化合物a，化合物b 更容易脱亚胺（CH2=NH）产生m/z297.062 2。所以，鉴定有关物质15 是咪达唑仑高温条件下产生双键位置异构的化合物（图15）。

Figure 12 RS 4,9,12[M+H]+ions MS/MS fragmentation pathways

有关物质16 也是高温湿法降解特征杂质，并在湿法光照条件下产生，其［M+H］+的准确质量为343.064 69，与离子式C18H13ClFN2O2+相应；与咪达唑仑元素组成相比，多2 个O 元素，少NH；其主要特征碎片离子（图16）m/z315.0775（C17H13ClFN2O+）、297.068 5（C17H11ClFN）和123.024 6（C7H4FO+）均与有关物质3的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元，又m/z315离子与其［M+H］+脱去CO相应。所以，鉴定有关物质16是咪达唑仑苯并二氮杂䓬环上亚胺基水解开环，并氧化脱氨成醛，而形成的二苯酮类化合物，并通过合成对照品比对确证。

Figure 13 RS 14[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 14 Possible structures of RS 15

有关物质20 和22 同为氧化降解杂质，22 还是湿法光照条件下的特征降解杂质，测得有关物质20 和22［M+H］+的准确质量分别为273.059 55 和273.059 51，均与离子式C15H11ClFN2+相应，两者互为同分异构体，与咪达唑仑元素组成相比，少C3H3N，与咪唑环的开环重排异构化相应。

有关物质22 的主要特征碎片离子（图18）m/z177.023 2（C9H6ClN2+），比其［M+H］+少96，与其结构中易发生氟苯基裂解相应，其他裂解特征均与氯苯并1，3-哌嗪特征结构相应；MS 及合成对照品比对，确证有关物质22 其是咪达唑仑上咪唑环断裂，同时七元杂环发生重排产生的特征光降解杂质，在氧化条件下也易生成。

有关物质20 的主要特征碎片离子m/z256.036 0（C15H8ClFN+）、221.065 8（C15H8FN+·）和201.061 2（C15H7N+·），分别为［M+H］+脱NH3、进一步脱去一个Cl 原子、或继续脱去1 分子HF 产生。推测，咪唑环的开环重排异构化有3种可能的结构（图17），其中化合物b 不易脱NH3离子，化合物c虽易脱NH3，但其结构中含有伯氨基，极性相对较大。所以，鉴定有关物质20 具有氮杂䓬的环烯单亚胺结构的化合物（图17-a，图18）。

Figure 15 RS 15[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 16 RS 16[M+H]+ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 17 Possible structures of RS 20

Figure 18 RS 20,22[M+H]+ions MS/MS fragmentation pathways

4 讨 论

在建立的LC-MC 联用鉴定条件下，盐酸咪达唑仑与各有关物质均得到有效的分离，共检测到22个有关物质，其中8个为工艺相关的中间体或副产物杂质：5、6、8、11、13、17、18 和19；有11 个为分降解产物：1、2、4、7、9、12、14、15、16、20 和22；3 个既是工艺杂质也是降解杂质：3、10和21。

强制降解试验表明，盐酸咪达唑仑在酸、碱条件下咪达唑仑结构中七元杂环上亚胺基易发生水解开环，生成特征有关物质3；在高温湿法条件下，容易产生咪达唑仑异构体（有关物质15、21）；在氧化、光照条件下，咪达唑仑结构中的咪唑环和苯并二氮杂䓬环上亚胺基易水解开环并氧化为二苯酮类降解杂质，或氧化为内酰胺、羟基取代转化物和N 氧化杂质。因此，盐酸咪达唑仑原料药应避光、阴凉暗处密闭存储。

此外，临床上咪达唑仑常被制成糖浆剂［17］，并加入枸橼酸等辅料矫味，故枸橼酸也可能参与水解，生成二苯酮胺的枸橼酸酰胺潜在制剂特征有关物质S1，其脱H2O则形成有关物质S2（图19），它们均已经通过杂质谱分析、MS及对照品比对确证。

Figure 19 Synthesis of the RS S1 and S2

通过LC-MS 技术对盐酸咪达唑仑有关物质进行分析研究，探讨了其杂质来源和降解途径，为其贮藏条件制定、工艺优化提供了依据，为更好的质量控制提供了参考，为稳定性研究奠定了基础［18-19］。