基于黑磷的药物递送系统在肿瘤诊疗中的研究进展

杨慧珍，牟伟伟，刘永军，张 娜

（山东大学药学院，天然产物化学生物学教育部重点实验室，济南250012）

黑磷（black phosphorus，BP）是一种非金属层状半导体，其于1914 年被Bridgman 首次发现［1］。BP 可以根据层数或形态进行分类：根据层数可分为单层BP、双层BP和多层BP；根据形态可分为BP量子点（BP quantum dots，BPQDs）、BP 纳米片（BP nanosheet，BPNSs）、BP 纳米颗粒等。BP 具有正交结构且是反应活性最低的磷同素异形体，其晶格是一个相互链接的六元环，如图1-A 所示。二维BP 在相互垂直的两个方向上分别呈锯齿状（zigzag direction）和扶手椅状（armchair direction）排布，导致其具有明显的结构各向异性［2］，如图1-B 所示。这种独特的结构使BP 形成诸多特殊性质，包括巨大的比表面积、良好的机械柔韧性、随层数可调的直接带隙、超高的光热转换效率等。此外，BP还具备良好的生物相容性与生物可降解性。基于以上优势，BP 纳米材料在光声成像（photoacoustic imaging，PA）、光热治疗（photothermal therapy，PTT）、光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）、药物装载等生物医学研究领域展现了良好的应用前景。然而，BP 的易氧化降解特性可导致BP 光学性能迅速退化，限制了其应用。利用脂质或聚合物材料对其进行包被，构建基于BP 的药物递送系统，提高BP 的稳定性，同时实现其肿瘤部位定位递送，提高肿瘤的诊疗效果成为目前研究的热点。

图1 黑磷结构(A)黑磷晶格结构图(B)黑磷晶体结构图

1 黑磷在肿瘤诊疗中的作用

1.1 光声成像

PA 是一种在医学领域中迅速成熟的成像技术，它利用光声效应（光进来，声音输出）将光学成像和声学成像的对比度、特异性、高分辨率结合起来［3］。PA 为非侵入性生物医学成像技术，依靠生物组织对光的特异性吸收进行成像，能在5～6 cm深的组织获得高空间分辨率图像，可应用于肿瘤的鉴别［4］。而在肿瘤的早期阶段，许多疾病特征分子在可见光区（400～750 nm）和传统的近红外区（750～900 nm）下光吸收能力较弱，受到激光激发时无法产生足够的光声信号以达到理想的成像对比度［5］。因此，利用具有特异性光学吸收特性的纳米探针作为光声外源造影剂可以提高成像对比度，改善图像分辨率，对于PA 的临床应用具有重要的意义。

BP由于其独特的电子和光学特性在光检测能力上表现出巨大潜力，成为光声外源材料造影剂的新材料。单层BP 具有从0.3～2.0 eV 的可调谐带隙，多层BP 可以允许在宽光谱区域上的光检测［6］。如Sun等［7］利用钛配体TiL4稳定BPQDs得到TiL4@BPQDs，TiL4@BPQDs 在680 nm 处展现出最强PA 信 号。浓 度 为22.0×10-6mol/L 时，TiL 4@BPQDs 的PA 信号较金纳米棒高了近7.29 倍。在MCF7 荷瘤BALB/c 裸鼠中，即便是微小肿瘤病变（仅有63 万个细胞），TiL4@BPQDs 也具备优良的PA 成像能力，表明TiL4@BPQDs 具有良好的PA性能和临床应用前景。

1.2 光热/光动力治疗

PTT和PDT都属于光疗，具有低侵入性和高治疗效率的优点。PTT 利用富集在肿瘤部位的光热试剂，在入射光激发下，利用光热转换效应产生热量，使肿瘤局部温度升高杀伤肿瘤细胞［8］。PDT 利用光动力效应，在特定波长照射下，活化聚集在肿瘤组织的光敏药物，将能量传递给周围的氧，生成单态氧杀伤肿瘤细胞［9］。BP 具有较大的消光系数以及将近红外光转化为热的能力，BPQDs和BPNSs可应用于肿瘤PTT 和PDT［10-11］。例如，BPQDs 光热转换效率达到28.4%，在808 nm 处消光系数为14.8 L·g-1·cm-1。BPQDs的光热性能即使经过5次间断的激光循环也无明显下降趋势，具有良好的光稳定性［12］。BPNSs 是产生单线态氧的有效光敏剂，用玫瑰红作为标准光敏剂，BPNSs 产生单线态氧的量子产率是0.91，可用于肿瘤PDT［13］。值得注意的是，BP 的尺寸和生物稳定性是影响其PDT和PTT 能力的重要因素：聚合物等材料的包被在增强BPNSs 生物稳定性的同时，可增强BP 固有的PTT 和PDT 效应；一般来说，尺寸较大BPNSs 具有更好PDT和PTT能力［14］。

1.3 药物装载

BP 的高比表面积和褶皱的晶格结构，可以用于药物的装载。同时BP 在水中带负电，荷正电的小分子药物可以通过静电作用封装在BP 褶皱层中［15］。例如，Chen 等［16］利用BPNSs 作为药物传递系统，以荷正电的阿霉素（doxorubicin，DOX）作为模型药物，通过静电作用修饰在带负电荷BPNSs表面制备BPNSs@DOX。结果显示由于BPNSs 较高比表体积和多褶皱结构，DOX 负载量可达950%。在近红外光808 nm 照射下，BPNSs@DOX引起肿瘤组织温度升高而导致肿瘤消融，同时，BPNSs@DOX 表现出光响应性药物释放特性，近红外光照射时DOX 释放加速，增强治疗效果。Jin等［17］设计了一种基于BPNSs 的药物释放系统，研究了负载氟西汀（fluoxetine，Flu）BPNSs 的抗抑郁作用。Flu 通过静电作用吸附在BPNSs 表面制备BP-Flu。结果显示BP-Flu 具有较高Flu 承载能力，药物负载量可以达到700%。在近红外光808 nm照射下，BP-Flu 温度以剂量依赖性方式升高，30 min 后90%以上Flu 可以释放出来，表现出良好的光响应特性。

1.4 生物活性磷基药物疗法

最近研究发现，BP 易被肿瘤细胞通过胞吞作用摄取，主要通过“巨胞饮→晚期内吞体→溶酶体”和“小窝蛋白介导的摄取通路”进入细胞，并被快速降解，在胞内产生大量磷酸根阴离子［18-19］（如图2）。磷酸阴离子的升高影响细胞ATP 水解，导致肿瘤细胞内环境改变，引起G2/M 期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖。被抑制的肿瘤细胞通过靶向性凋亡和自噬途径进入程序化细胞死亡。研究团队将这一源自BP 天然生物活性的肿瘤细胞选择性杀伤作用称为“生物活性磷基药物疗法（bioactive phosphorus-based therapy）”。该研究是BP 的新应用之一，目前尚在研究中。

图2 生物活性磷基药物疗法作用机制图

2 黑磷递送系统构建策略

目前已有多种基于BP 的递送系统被报道［20-21］，根据体系的不同，可分为纳米系统和原位凝胶系统。纳米系统使用聚合物或脂质膜对BP进行包被，克服BP 易氧化和易化学降解的缺点，提高其在血液循环中的稳定性，增加BP 在肿瘤组织中蓄积，提高BP 进入肿瘤细胞的能力，获得理想的肿瘤治疗效果。原位凝胶系统使用原位凝胶对BP 进行包裹，增强BP 稳定性，延长药物在用药部位滞留时间，实现BP 在肿瘤组织或肿瘤细胞内的可控释放，提高肿瘤治疗效果。

2.1 黑磷纳米系统

2.1.1 聚合物包被黑磷 聚合物被认为是一种很有优势的包裹材料，一般具有相对较差的光吸收和热导率，不影响BP 光学性质，可以隔离水、氧与BP的接触，提高BP的稳定性。通常选择良好生物相容性及生物可降解性的材料，如聚多巴胺（polydopamine，PDA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（lactic-co-glycolic acid，PLGA）等。

Shao等［22］采用乳化溶剂挥发法，利用PLGA 包裹BPQDs，制备了核壳结构载BPQDs 的纳米球（BPQDs/PLGA）。疏水性的PLGA 不仅可以将BPQDs 与氧气和水隔离，提高BPQDs 的稳定性，还可以控制BPQDs 的降解速率。PLGA 包裹后，BPQDs 可以保持8 d 以上的光热稳定性，同时降低BPQDs 的降解速率。Li 等［23］采用自聚合法制备PDA 包覆的BPQDs（BP@PDA）。其中富含苯酚基团的PDA 能够清除活性氧（reactive oxygen species，ROS），可有效防止BPQDs 氧化，从而提高稳定性。实验证明10 d 后，BP@PDA 中BPQDs 降解率为10%，而纯BPQDs 降解率为90%。此外，修饰PDA 后可使BPQDs 的光热转换效率从22.6%提高到64.2%。与PBS 对照组相比，在荷A375 瘤裸鼠给予BP@PDA，在近红外光808 nm 照射下有效抑制了肿瘤生长，抑制率接近100%（P＜0.001）。

2.1.2 脂质体包被黑磷 脂质体（liposome）具有良好的安全性与稳定性，可与细胞膜融合促进细胞摄取，是临床广泛使用的纳米药物载体之一。构建liposome-BP 体系，具备脂质体和BP 双重优势，有助于提高BP 的稳定性。通常可选择具有光响应和热响应的新型脂质体，如光敏脂质体和热敏脂质体等。在提高BP 稳定性基础上，同时提高BP靶向性和光热能力［24-25］。

研究人员报道了一种liposome-BPQDs［26］，在5周内，liposome-BPQDs 的光热效应减弱速度（约25%）小于BPQDs（约40%），且随着时间延长，BPQDs 颜色发生明显变化，表明BPQDs 发生降解；而liposome-BPQDs 颜色几乎没有变化，说明Liposome-BPQDs 稳定性优于BPQDs。Zhang 等［25］利用热敏脂质体包裹BPQDs 和万古霉素（vancomycin，vanco）制备BPQDs-vanco@liposome，脂质体包裹能有效防止BPQDs 的降解并保持其光热性能。在近红外照射下，BPQDs 光热效应引起的局部升温，导致BPQDs-vanco@liposome 结构破坏释放万古霉素杀灭细菌。

2.2 原位凝胶包被黑磷

原位凝胶具有最小侵入性和潜在控释能力。原位凝胶包被BP，有助于提高BP 稳定性，同时具有一定的缓释能力。如选择温度敏感型凝胶包被BP，设计光控可逆相变的温敏型凝胶，可实现通过波长、功率密度、曝光时间等光参数对BP 释放速率的远程调节。此外，利用BP 的光热转化能力，升高水凝胶温度，可加速温敏类水凝胶在治疗部位的分布。

Qiu 等［27］用 低 熔 点 琼 脂 糖 和 聚 乙 二 醇 化BPNSs 制备了可生物降解的智能水凝胶BP@Hydrogel。BP@Hydrogel 瘤内注射后为凝胶态，在近红外光照射下，BP 将光能转化为热能，BP@Hydrogel 逐渐软化、熔融和降解，BP 释放。通过调节处方因素如琼脂糖、BP浓度等和光照参数如光强、暴露时间等可以控制BP 释放速率。荷瘤裸鼠瘤内注射BP@Hydrogel后，在光照下实现可控的肿瘤光热治疗，有效抑制肿瘤生长。Shao 等［28］将BPNSs与热敏水凝胶［聚（d，l-丙交酯）-聚乙二醇-聚（d，l-丙交酯）（PDLLA-PEG-PDLLA：PLEL）］结合，制备BP@PLEL 水凝胶。BP@PLEL 具有良好的光热性能。在裸鼠荷HeLa 细胞肿瘤模型中，手术切除主体肿瘤后在切除处喷射BP@PLEL，在808 nm 红外照射下，BP@PLEL快速形成胶化膜，同时光热作用清除术后残留的肿瘤组织。荷瘤小鼠经手术和PTT 治疗后16 d 内完全治愈，可存活两个月以上，无复发。相反，仅接受肿瘤切除手术的荷瘤小鼠表现出高复发率（80%）。

3 基于黑磷的药物递送系统

药物耐药性、肿瘤多样性以及患者个体差异等限制了单一疗法的临床治疗效果，因而肿瘤治疗常用联合治疗方案。BP具有良好PTT/PDT 治疗效果，可联合其他治疗手段用于肿瘤的协同治疗，也可利用其PA能力，实现肿瘤的诊疗一体化。

3.1 化学光疗联合治疗

化疗是目前治疗肿瘤最主要的手段之一，将抗肿瘤药物与BP 联合，可实现光疗和化疗的联合治疗，提高肿瘤治疗效果。例如，Tao 等［19］首次通过静电作用将DOX 负载到聚乙二醇化BPNSs 上，制备了BP-PEG/DOX NSs。在808 nm 红外照射下产生局部高热，用于肿瘤光热治疗，同时驱动DOX释放。BP-PEG/DOX NSs 表现出pH 和近红外光响应型药物释放特性。靶向因子叶酸（folic acid，FA）进一步修饰BP-PEG/DOX NSs，研发了BPPEG-FA/DOX NSs 递送系统。与BP-PEG-FA/DOX NSs 治疗组（约55%）相比，BP-PEG-FA/DOX NSs+NIR 治疗组的肿瘤抑制明显，抑制率约为91%。Zhang 等［29］通过静电作用，在BPNSs 表面包覆了盐酸米托蒽醌（mitoxantrone hydrochloride，MTX）和透明质酸（hyaluronic acid，HA），研制了共给药系统（BP@MTX-HA NSs）。BP@MTX-HA NSs 不仅具有良好的物理稳定性和光热转换效率，而且具有独特的pH/NIR 激光触发释药能力。在荷4T1瘤小鼠中，与生理盐水组比较，BP+NIR 治疗组和MTX治疗组有一定的治疗作用，肿瘤负荷值分别为2.15%和2.22%；而BP@MTX-HA NSs+NIR 组肿瘤抑制效果最优，肿瘤负荷值为1.13%（P＜0.05）。Wang 等［30］将BPQDs 以 及 化 疗 药 多 烯 紫 杉 醇（docetaxel，DTX）共载入PLGA 粒中，制备了BP/DTX@PLGA。在近红外光照射下，BP/DTX@PLGA 96 h 累积释放率约为64%，显著高于无照射组约38%（P＜0.05），同时表现出良好的热化疗协同治疗效果。

3.2 免疫光疗联合治疗

近年来，免疫治疗作为一种新型抗肿瘤手段备受关注，其通过激活自身免疫系统杀伤肿瘤细胞，具有特异性和作用时间长的特点［31］。将PTT/PDT 与免疫治疗联合，PTT/PDT 直接杀伤肿瘤组织，凋亡的肿瘤细胞导致肿瘤抗原的释放，促进抗原递呈从而加强免疫治疗，具备协同抗肿瘤作用［32］。例如Li等［33］通过PEG和ROS敏感的聚丙硫醚［poly（propylene sulfide），PPS］接枝BPQDs 自组装制备了载免疫佐剂CPG 寡核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CPG ODNs）的近红外/ROS 敏感的BPQDs 囊泡（BPNVs-CPG）。在近红外光照射下，BPNVs-CPG 中BPQDs 产生ROS 有效地诱导肿瘤细胞死亡，引发原位免疫源性细胞死亡；BPNVs-CPG 表面的ROS 敏感型聚合物PPS 被降解从而引发BPNVs-CPG 解组装，释放CpG。CpG 被抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APCs）吞噬，提升APCs 的成熟程度与抗原呈递能力，继而引发机体的抗肿瘤免疫应答，实现对肿瘤的免疫光疗联合治疗。与对照组比较，CPG 治疗组表现为轻度抑制，BPNVs 治疗组表现为中度抑制，BPNVs-CPG+NIR 治疗组肿瘤抑制明显。Ye 等［34］利用肿瘤细胞膜作为抗原（cancer cell membrane nanovesicle，CCNVs）包裹BPQDs 制备纳米肿瘤疫苗（BPQDCCNVs）。然后将BPQD-CCNVs、集落刺激因子（granulocyte-macrophage clony-stimulating factor，GM-CSF）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）共装载于温敏水凝胶制备光热肿瘤疫苗复合物（Gel-BPQD-CCNVs）。在近红外光照射下，BPQDs 产生光热效应诱导温敏水凝胶触发释放肿瘤抗原、GMCSF 和LPS，招募抗原递呈细胞捕获肿瘤抗原并实现抗原有效递呈。该载体联合aPD-1 阻断免疫检查点通路，在小鼠乳腺癌和黑色素瘤模型中有效抑制了术后肿瘤复发和转移。Liang等［35］用红细胞膜（erythrocyte membranes nanovesicle，RMNV）包覆BPQDs 制备红细胞膜纳米囊泡（BPQD-RMNV），并与aPD-1 联用用于乳腺癌治疗。近红外照射导致4T1乳腺肿瘤细胞凋亡，促进抗原释放与递呈。同时，aPD-1 解除肿瘤免疫抑制作用，增强免疫治疗效果。与对照组相比，BPQD-RMNVs+Laser+aPD-1治疗组在体内显著抑制了基底样乳腺癌的生长。

3.3 多种光疗模式联合治疗

单独使用PTT 或PDT 的治疗效果不够令人满意，如PTT 治疗导致肿瘤内热量分布不均，PDT 治疗受缺氧肿瘤微环境的限制等［36-37］。PTT 与PDT协同治疗是一种很有前途的方法。BP 有良好PTT和PDT 能力，可用于PTT 和PDT 联合治疗，提高肿瘤治疗效果。Yang 等［38］通过静电作用，在聚乙二醇化BPNSs 表面固定了二氢卟吩e6（chlorin e6，Ce6），制备BP@PEG-Ce6 用于靶向PTT/PDT 联合治疗肿瘤。Ce6 是一种具有近红外光吸收特性的光敏剂，用于增强BPNSs 的PDT 和PTT 能力。BP@PEG/Ce6不仅具有良好生物相容性、物理稳定性和肿瘤靶向性，而且具有较高的光热转换效率（43.6%）。在660 nm 激光照射下，BP@PEG/Ce6可有效的产生光热和ROS，光热一方面可以直接杀伤肿瘤细胞，另一方面可以加快光敏剂Ce6 的释放，产生大量ROS，导致肿瘤细胞凋亡和坏死。与BP@PEG/Ce6 治疗组（约27%）相比，荷4T1 瘤小鼠给予BP@PEG/Ce6后，在近红外光照射下具有明显增强抗肿瘤作用，抑制率约为99%（P＜0.05），实现了光热和光动力结合的肿瘤治疗。Yang 等［10］将Ce6 和三苯基膦（triphenylphosphine，TPP）共价修饰到PDA 包埋的BPNSs（BP@PDA NSs）上，构建了靶向线粒体的BP@PDA-Ce6＆TPP NSs，用于协同PTT 和PDT 肿瘤治疗。利用9，10-蒽基-双（亚甲基）二丙二酸作为探针检测光动力学性能，证实BP@PDA-Ce6＆TPP NSs 具有高效生成ROS 能力。即使在低浓度和低功率条件下，BP@PDACe6＆TPP NSs 也会引起肿瘤组织温度快速升高。表明BP@PDA-Ce6＆TPP NSs 具有良好PTT 与PDT效应。与对照组相比，BP@PDA-Ce6＆TPP NSs 组小鼠肿瘤在14 d 内完全治愈，证明BP@PDACe6＆TPP NSs具有良好的肿瘤消融效果。

3.4 诊疗一体化

诊疗一体化是一种将疾病的诊断或监测与治疗有机结合的策略。BP 具有良好PTT 和PDT 能力，并且是一种优良的PA 造影剂，可同时用于肿瘤的诊断和治疗。Deng 等［39］用葡聚糖（dextran，DEX）和聚乙烯亚胺［poly（ethyleneimine），PEI］对BP 纳米粒进行改性（BP-DEX/PEI），使其具有生物相容性和稳定性。在BP-DEX/PEI 纳米粒上装载靶向因子叶酸（FA）和荧光染料硫氰酸7-羟基琥珀酰亚胺酯（sulfo-cyanine7 NHS ester，Cy7-Se），分别用于肿瘤靶向PA 成像和近红外荧光成像（nearinfrared fluorescence imaging，NIRF）。 BP-DEX/PEI-FA/Cy7 纳米粒具有较高的光热转换效率（41%）和成像能力，可用于肿瘤的体内靶向成像（PA、NIRF）和PTT。与对照组相比，BP-DEX/PEIFA/Cy7+NIR治疗组获得肿瘤图像具有更加理想的亮度和强度，肿瘤抑制明显（100%），有望用于肿瘤的诊断和治疗。

4 展 望

BP 是一种新型的二维纳米材料，具有优良的PA、PTT/PDT 治疗与药物装载能力，并由于其低毒性以及良好的生物相容性，成为一种极具应用前景和临床发展潜力的递送系统和治疗剂。虽然基于BP 的药物递送系统在肿瘤诊疗研究中取得很大进展，但仍存在一些科学问题有待解决。（1）BP在空气中易氧化，严重限制了其应用；（2）虽然BP具有短期安全性，但长期使用是否会引起磷酸根离子过量中毒，还需要进一步考察；（3）BP 在体内与生物分子或细胞相互作用的机制尚需进一步研究。为了推动BP 向临床应用转化，应进一步深入研究有效抗氧化策略、BP 的体内安全性和BP 的生物药剂学性质等。随着现代药剂学和材料学的发展，这些问题将会逐步解决，相信在不久的将来，BP将在生物医学领域有更广泛的应用。