铝碳酸镁对阿司匹林损伤人胃黏膜上皮细胞的保护作用及其机制研究

刘琳娜 丁士刚 贾淑娟

北京大学首钢医院消化科1(100144) 北京大学第三医院消化科2

背景：长期服用阿司匹林可造成不同程度的胃黏膜损伤。铝碳酸镁可通过多种机制对胃黏膜损伤发挥保护作用。目的：通过体外实验探讨铝碳酸镁对阿司匹林相关胃黏膜损伤的保护作用及其可能机制。方法：选取人胃黏膜上皮细胞株GES-1，设置正常对照组、损伤组和保护组，后两组加入阿司匹林9 mmol/L共培养，保护组进一步予0.6 mg/mL铝碳酸镁干预。培养12 h后，使用倒置生物显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态学变化，MTT实验和流式细胞术检测细胞存活和凋亡情况，蛋白质组学技术筛选、鉴定损伤组与保护组差异表达蛋白。结果：与损伤组相比，保护组GES-1细胞结构相对完整，细胞存活率高、凋亡率低，差异均有统计学意义(P<0.05);T复合蛋白1β亚基(TCP-1β)和硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶3(PRX3)表达上调，两种蛋白分别与蛋白质的折叠和组装、细胞骨架功能以及抗氧化应激有关。结论：铝碳酸镁可通过促增殖、抗凋亡减轻阿司匹林相关胃黏膜损伤，其机制可能与改善细胞内蛋白质结构和功能、抗氧化应激等有关。

低剂量阿司匹林广泛应用于心脑血管事件的预防。然而，长期服用阿司匹林会增加患者的胃肠道疾病风险，如消化不良、消化性溃疡出血甚至因大出血致死。阿司匹林相关胃黏膜损伤可诱发溃疡和出血[1-2]，然而，由于阿司匹林的镇痛作用，溃疡患者的腹痛症状往往不明显，从而延误诊治，对此类人群应予足够的重视。铝碳酸镁是一种具有层状网络晶格结构的药物，能通过中和胃酸、加强胃黏膜屏障功能、阻断损伤因子而有效保护胃黏膜[3-7]。本文通过体外实验探讨铝碳酸镁对阿司匹林相关胃黏膜损伤的保护作用及其可能机制。

材料与方法

一、细胞株、主要试剂和仪器

人胃黏膜上皮细胞株GES-1(北京康为世纪生物科技有限公司)；阿司匹林(纯度≥ 99%)、PI(Sigma-Aldrich®, Merck KGaA)；铝碳酸镁(拜耳医药保健有限公司)；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

WMS-3680研究级倒置生物显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)；JEM-1400Plus 透射电子显微镜(日本电子株式会社)；BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences)；电泳仪(Bio-Rad Laboratories, Inc.)；DuoScan T1200扫描机(Agfa-Gevaert Group)；冷冻高速离心机、酶标仪、CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 细胞培养和分组处理：GES-1 细胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，培养于37 ℃、50 mL/L CO2、饱和湿度环境培养箱中，每周换液3次，细胞生长至约80%融合时，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，1∶3传代。实验设置3个组别：正常对照组细胞不予任何处理；阿司匹林损伤组(简称损伤组)加入阿司匹林9 mmol/L共培养；铝碳酸镁保护组(简称保护组)在阿司匹林处理的基础上予0.6 mg/mL铝碳酸镁干预。每组设3个复孔。

2. 细胞形态学观察：各组GES-1细胞培养12 h后，倒置生物显微镜下观察细胞形态和生长状态。收集各组细胞，离心、固定，环氧树脂包埋，乙酸铀-柠檬酸铅双重染色，超薄切片机切片，透射电子显微镜下观察、拍照。

3. MTT实验：取处于对数生长期的GES-1细胞，以每孔0.5×104加入96孔培养板，细胞贴壁后，按前述方法分组和处理。细胞培养12 h后，每孔加入200 μL MTT，4 h后吸出培养基，每孔加入150 μL DMSO，室温震荡10 min溶解，使用酶标仪测定550 nm波长处吸光度(A)值。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100%。

4. 流式细胞分析：各组GES-1细胞培养12 h后，收集细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL细胞悬液，PBS 洗涤3 次，将细胞重悬于1 mL PI染液中，30 min后上流式细胞仪检测，分析细胞凋亡情况。

5. 双向凝胶电泳：各组GES-1细胞培养12 h后行蛋白质组学分析。①等电聚焦：使用17 cm线性胶条，上样量为每胶120 μg，转至浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶。②电泳：每胶10 mA，30 min；每30 mA，5 h。银染后扫描，ImageMaster 5.0 2D胶分析软件结合手工操作进行分析，得到差异表达蛋白质点。切取蛋白质点以胰酶进行胶内酶解，检索Mascot数据库(http://www.matrixscience.com/)确定蛋白质名称和功能。

三、统计学分析

结 果

一、细胞形态学变化

倒置生物显微镜下，正常对照组GES-1细胞呈长梭型，细胞形态饱满，状态良好，均一贴壁生长，培养基清亮；损伤组和保护组贴壁细胞数量均减少，与保护组相比，损伤组悬浮细胞增多，部分细胞核浓缩，细胞质萎缩(图1)。

A：正常对照组细胞形态饱满，状态良好；B：损伤组悬浮细胞增多，贴壁细胞减少；C：保护组可见悬浮细胞，但数量明显少于损伤组

透射电子显微镜下，正常对照组GES-1细胞形态规整，胞核位于细胞中央，核膜完整，线粒体等细胞器分布于胞质中；损伤组细胞结构缺乏完整性，胞膜和核膜有不同程度的缺损，胞质中细胞器减少，细胞呈现坏死状态；保护组胞核呈现不规则的多样性，但细胞结构保持完整性(图2)。

A：正常对照组细胞胞核位于细胞中央，核膜完整；B：损伤组细胞结构缺乏完整性，胞膜和核膜缺损，细胞器减少，呈现坏死状态；C：保护组细胞结构保持完整性

二、细胞存活和凋亡情况

MTT实验结果显示，损伤组和保护组GES-1细胞存活率分别为19%和46%，保护组明显高于损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)。

流式细胞分析显示，损伤组和保护组GES-1细胞凋亡率分别为30.6%和15.3%，保护组明显低于损伤组，差异有统计学意义(P<0.05；图3)。

图3 损伤组和保护组GES-1细胞凋亡流式细胞分析图

三、差异表达蛋白筛选和鉴定

蛋白质组学分析显示，与损伤组相比，保护组有2种蛋白表达上调，名称分别为T复合蛋白1 β亚基(T-complex protein 1 subunit beta, TCP-1β)和硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶3(thioredoxin-dependent peroxide reductase 3, PRX3；图4)，功能分别为减轻细胞炎症反应和保护细胞抵抗氧化应激。

1: TCP-1β;2: PRX3

讨 论

阿司匹林是一种常用的解热镇痛药物，长期服用可造成不同程度的胃黏膜损伤，引起溃疡和出血[1-2]。既往研究显示，阿司匹林对胃黏膜细胞的损伤作用与抑制生长因子如血小板衍生生长因子AB(PDGF-AB)、血管内皮生长因子(VEGF)表达、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等机制有关，氧化应激在阿司匹林相关胃黏膜损伤中也发挥重要作用[2，8-10]。有研究[10]显示，阿司匹林可能通过抑制Nrf2/HO-1抗氧化通路上调胃黏膜上皮细胞内的活性氧(ROS)水平，产生氧化应激，抑制细胞活力。

铝碳酸镁是一类具有抗酸和胃黏膜保护作用的非处方药，可通过中和胃酸、抑制胃蛋白酶活性、增加前列腺素E2合成、促进表皮生长因子释放、结合胆汁酸等多种药理学作用保护胃黏膜、减少损伤和破坏胃黏膜的因素、促进溃疡面修复，不良反应少而轻微[3-7]。本研究体外实验结果显示，经阿司匹林处理的人胃黏膜上皮细胞株GES-1发生明显的形态学改变，贴壁细胞减少，悬浮细胞增多，细胞结构缺乏完整性；予铝碳酸镁干预的GES-1细胞则能保持细胞结构完整性，与损伤组相比，细胞存活率增高，凋亡率降低，差异均有统计学意义。进一步采用蛋白质组学技术筛选损伤组与保护组的差异表达蛋白，发现保护组TCP-1β和PRX3蛋白表达显著上调。TCP-1β是一种伴侣蛋白，又称含TCP1伴侣蛋白亚基2(chaperonin containing TCP1, subunit 2, CCT2)，在真核细胞中主要参与协助蛋白质的折叠、组装、转运和降解，在DNA的复制和转录、细胞骨架功能、细胞内信号转导等方面也发挥重要生理作用[11-12]。研究表明CCTs可通过调节微管蛋白、肌动蛋白等，在肠道细胞微绒毛形成以及细胞的存活、迁移和侵袭中发挥重要作用[13-14]。本研究中保护组GES-1细胞高表达TCP-1β，提示其可能参与了铝碳酸镁的细胞保护作用。铝碳酸镁可能通过上调TCP-1β表达影响胃黏膜上皮细胞中的蛋白结构和功能，进而影响细胞状态，促进细胞存活，减轻阿司匹林相关胃黏膜损伤。PRX3定位于线粒体，具有强力抗氧化作用，可清除ROS，维持线粒体膜稳定性，保护对自由基敏感的酶类抵抗氧化应激损伤，并参与调节免疫炎症相关转录因子核因子-κB(NF-κB)激活，在线粒体抗氧化防御机制中起至关重要的作用[15-16]。本研究发现保护组GES-1细胞高表达PRX3，提示增强胃黏膜上皮细胞的抗氧化防御机制、维持线粒体稳定可能是铝碳酸镁对阿司匹林相关胃黏膜损伤发挥保护作用的机制之一。

综上所述，铝碳酸镁可通过促增殖、抗凋亡减轻阿司匹林相关胃黏膜损伤，其机制可能与改善细胞内蛋白质结构和功能、抗氧化应激等有关。然而，本研究仅在细胞水平进行了初步探讨，后续拟建立阿司匹林急性胃黏膜损伤动物模型，通过检测炎症因子和氧化应激相关因子的表达变化验证铝碳酸镁的细胞保护作用，同时通过体内外实验对TCP-1β和PRX3所涉及的信号通路作进一步研究。