都匀毛尖茶多酚氧化酶粗酶的酶学性质*

姚玉仙，张明泽，刘丽萍，徐 波

(黔南民族师范学院，贵州 都匀 558000)

茶产业是贵州省黔南州近年来进行农业结构调整、推进扶贫开发的重要产业之一[1]。黔南州茶树种质资源丰富，目前发现有200多个株系，既有适制绿茶的品系，也有适制红茶的品系，部分品系可兼制红绿茶[2]。为发展茶产业，实现多元化经营，茶产品类型逐渐增加，参照金骏眉加工工艺，利用都匀毛尖茶相同原料生产的都匀红茶产量迅速增长，其品质也独树一帜[3]。红茶发酵过程中主要生化成分变化是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC 1.10.3.1)催化引起的。PPO是一种Cu2+辅基结合酶[4]，其催化形成的茶黄素总含量与红茶整体品质及估值呈极显著正相关[5]，是形成红茶色泽与香气的关键酶。不同地区和不同品种茶树的PPO特性差异较大，酶的最适反应条件也有所差异[6]。因此，为进一步了解都匀地方茶树品种的酶学性质，本研究以都匀毛尖茶地方品种鲜叶为对象，研究其酶的最适反应条件，为筛选适制都匀红茶的茶树品系及优化茶叶加工提供参考。

1 实 验

1.1 材 料

材料：于夏季采摘都匀毛尖地方品种茶树鲜叶，采摘规格为一芽一叶。

试剂：石英砂(SiO2)、冷丙酮(C3H6O)、柠檬酸(C6H8O7)、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氢钠(H2NaPO4·2H2O)、不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、邻苯二酚(C6H6O2)、脯氨酸，所有化学试剂均为分析纯级，所有用水均为蒸馏水。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶提取[7]

取鲜叶10 g、冷丙酮40 mL、PVPP 2 g于冷冻的研钵中，快速研磨直至匀浆，抽滤，滤渣用80%冷丙酮淋洗至无色，此时滤渣即是丙酮粉。将1∶3(重量体积比)的丙酮粉和pH 5.6的柠檬酸-磷酸缓冲液混合，加入少量石英砂混合置于低温环境中的冰研钵中研磨匀浆20 min，将匀浆好的混合液于4000 r/min的高速冷冻离心机(温度4 ℃)离心15 min，得上清液，即PPO粗酶液，4 ℃保存备用。

1.2.2 酶活力测定[7]

取粗酶液1 mL，加反应混合液3 mL(2 mL pH 5.6柠檬酸磷酸缓冲液、0.4 mL 0.1%脯氨酸溶液、0.6 mL 0.1 mol·L-1邻苯二酚溶液)在37 ℃下温浴10 min后立即加入6 mol·L-1尿素液3 mL终止反应，4000 r/min离心10 min，上清液置于1 cm比色皿，在波长460 nm处测吸光度，空白对照的反应混合液中的邻苯二酚用缓冲液代替，其他条件相同。酶活力单位以每克样品每分钟A460改变0.01为一个活力单位(U)。

式中，V为样品体积，mL；T为反应时间，min；A460为反应终止时以空白为对照在460 nm处的吸光度。

1.2.3Km及vmax值测定

于五支离心管中加入酶液0.6 mL，分别加入0.1 mol·L-1邻苯二酚溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，再用pH 5.6柠檬酸-磷酸缓冲液补充至3.0 mL，按照1.2.2步骤处理后测定吸光度。按以下公式计算Km值和vmax值。

式中，U为测得的酶活力，Km为米氏常数，mol·L-1；v为酶促反应速率，vmax为酶的最大反应速率，U/min；[S]为底物浓度，mol·L-1。采用双倒数方程计算出Km和vmax的值，即是1/v=(Km/vmax)×(1/[S])+1/vmax，以底物浓度倒数(1/[S])为横坐标，反应速率倒数(1/v)为纵坐标，通过求得两者的线性函数关系，推出Km值和vmax值[8]。

1.2.4 不同温度和pH处理后测定PPO酶活力

在试管中加入PPO酶液0.6 mL、0.1 mol·L-1邻苯二酚0.6 mL、pH 5.6柠檬酸-磷酸缓冲液1.8 mL混匀作为反应体系溶液(不同pH处理的反应体系与此相同)，分别在20～70 ℃(10 ℃为一个梯度变化)下水浴10 min，测定各温度下PPO的吸光度。pH 3.0～8.0(pH 0.5为一个梯度变化)的反应体系溶液于37 ℃水浴10 min后测定混合液PPO的吸光度。pH 3.0～5.5缓冲液用柠檬酸和磷酸氢二钠配制，pH 6.0～8.0缓冲液用磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制。

2 结果与讨论

2.1 不同邻苯二酚浓度下PPO反应速率及Km值

由表1可知，都匀毛尖茶鲜叶PPO反应速率随邻苯二酚浓度增加而增大。采用双倒数作图法(图1)，得到PPO酶活力的动力学方程式：1/v=0.0189×1/[S]+0.1328，R2=0.9803，根据米氏方程的倒数形式推导出Km/vmax=0.0189，1/vmax=0.1328，可以确定vmax值为7.5301 U·min-1，Km值为0.1423 mol·L-1。同一反应体系下的Km越大说明催化活力越低，越小则催化活力越高。

表1 不同邻苯二酚浓度下都匀毛尖鲜叶PPO反应速率Table 1 The reaction rate of PPO in fresh leaves with different concentrations of catechol

图1 鲜叶PPO催化邻苯二酚的双倒数曲线Fig.1 Double reciprocal plots of PPO in fresh leaves with catechol as substrate

2.2 温度对PPO酶活力的影响

在20～70 ℃的温度范围内，测定PPO的活力，温度对PPO活力的影响结果见图 2。

图2 温度对PPO酶活力的影响Fig.2 Effect of temperature on PPO activity

由图2可知，当温度在20～30 ℃条件下，PPO活力随着温度的升高而上升，至30 ℃达到最高值；温度高于30 ℃时PPO活力迅速下降，到达60 ℃时，PPO活力消失，这可能是由于PPO是一种蛋白质，不适宜的温度会破坏PPO活性部位三维结构的完整性，而这种结构又是保持酶活力的关键因素[9]。适宜温度范围内酶催化反应速度随温度升高而加快，但超过某一温度时蛋白质变性，酶活力消失。因此在利用都匀毛尖茶鲜叶加工红茶过程中应选择30 ℃左右的温度发酵。

2.3 pH值对PPO酶活力的影响

在pH值为3.0～8.0的缓冲液中测定都匀毛尖茶鲜叶PPO粗酶的活性，pH值对PPO活力的影响结果见图3。

图3 pH值对PPO酶活力的影响Fig.3 Effect of pH on PPO activity

由图3可知，茶树鲜叶PPO活力的最适pH值为4.0左右。当pH降为3.0时，PPO活力明显降低；当pH从4.0逐渐增加到5.0时，PPO酶活力急剧下降。当pH大于7.5时酶活力又明显上升，出现肩峰可能是由于茶叶存在多个多酚氧化酶同工酶引起的[10]，这些酶的最适pH会受到同工酶的数量、比例及性质的影响。在都匀红茶加工过程中可以根据这一性质考虑一些相关措施，如使用柠檬酸等食用酸来调控pH值在3.5～4.5之间，促进酶的活力，缩短发酵时间。

3 结 论

关于pH对茶树PPO活力影响的相关研究报道较多，但结果有所差异。研究显示，茶树品种福云6号[11]、槠叶齐[12]、白毫早[13]、乌牛早和平阳特早[14]粗酶的最适pH分别为8.6、5.6、6.0、8.6。本研究发现都匀毛尖茶鲜叶PPO粗酶的最适反应pH为4.0，这与伍梦瑶等[15]测定勐库大叶种PPO最适反应pH为4.4的结果较为相近。因此，不同茶树PPO粗酶活性的最适pH差异可能与品种有关。红茶发酵过程中叶片pH值逐渐降低而趋于酸性环境[16]，研究表明，偏酸性条件更利于红茶重要品质成分茶黄素的形成且保持稳定[17]。因此，PPO最适pH偏酸性的都匀毛尖茶地方品种适宜作为红茶加工的原料。发酵是红茶品质特征成分转化形成的关键工序，而PPO是茶多酚转化为红茶品质成分的关键酶[18]。PPO活性受发酵叶温的调控，传统红茶生产中发酵叶温一般为30 ℃左右[19]，采用先高温(30 ℃左右)后低温的发酵模式，有利于促进PPO酶活性的激活和后期活性的保持，促进初中级氧化产物的形成，充分发挥酶促氧化作用[18]。本研究表明，都匀毛尖茶PPO粗酶的最适反应温度为30 ℃，而此条件下发酵有利于与红茶品质呈正相关的茶黄素和茶红素含量的累积[20-21]，为了更好地控制红茶品质，尽量控制发酵在最适温度下进行。本研究结果为都匀毛尖地方品种红茶适制性研究提供参考。