不同施氮水平下棉花叶片最大羧化速率的高光谱估测

张鑫磊，刘连涛，孙红春，张 科，白志英，董合忠，李存东，张永江※

（1. 河北农业大学农学院/省部共建华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省作物生长调控重点实验室，保定 071001；2. 山东棉花研究中心，济南 250100）

0 引 言

植被光合作用是生态系统物质循环最为重要的一个环节，是地球系统一切生命活动的物质基础和能量来源[1]。植物光合作用对环境高度敏感，在多个环境因子的影响下，光合速率的准确模拟非常困难。在一些经典光合生理模型中，通常以叶片最大羧化速率（Maximum Carboxylation Rate，Vcmax）作为模拟光合作用的核心，因此叶片Vcmax的准确模拟对光合速率和植被生产力的预测至关重要[2]。Vcmax是由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶（Ribose-1,5-diphosphate Carboxylase / Oxidase，Rubisco）所催化的最大羧化反应速率，即植物叶片在单位时间单位面积所同化的最大CO2摩尔数[3]。植被叶片Vcmax作为光合作用的关键参数，受到光照、温度、水分等环境因素的影响[4-5]。土壤氮素水平影响植物叶片大小和叶片氮素含量，进而影响植物的光合作用速率、光合量子效率和相关碳代谢酶活性[6]。由于叶肉细胞光合系统中的Rubisco 酶、光捕获组分（叶绿素和相关蛋白）等均含有大量的氮元素，叶片含氮量对光合作用有显著影响[7]。叶片含氮量通常与Vcmax表现为线性正相关，但该关系具有较大的时空变异，在不同的地理位置、不同季节、不同的植被类型的研究结果表现出一定差异性[8-9]。张绪成等通过对小麦研究后发现，施氮量的提高有助于叶面积的增大和Rubisco 的合成，从而使叶片Vcmax显著提高[10]。Crous 等研究发现，施氮可以使火炬松叶片Vcmax与叶片含氮量关系式的斜率提升4.9%[11]。Walker 等研究表明，植被叶片Vcmax与叶片含氮量密切相关，增加叶片磷含量显著提高Vcmax对叶片含氮量的敏感性，但是这种关系并不稳固，易受到环境和物种影响[12]。叶绿素也与叶片Vcmax有关。Croft 等研究发现，由于季节和物种的变化，叶绿素与植被叶片Vcmax的相关性要显著高于叶片含氮量，且相较于叶片全氮含量，分配给Rubisco 的氮素含量与叶片Vcmax的相关程度要更为密切[13]。Qian 等通过研究多个类型植被后发现，叶片Vcmax与叶绿素有较为稳固的相关性，R2达到0.859，但是其研究并未涉及叶片含氮量[14]。

随着叶片Vcmax在植物生理生态模型中的重要性越发凸显，有关植被Vcmax的研究也日益增多，受限于传统测量方法的低效率，大范围的直接测量很难做到，如何快速、准确的测量植被Vcmax亟需解决。随着遥感技术的发展，高光谱遥感已经成为植被实时监测和营养诊断的有效手段[15-16]。Dechant 等研究表明，即使在大量树种和不同的光环境下，叶片反射率仍与植被Vcmax保持着较高的相关性，其中叶片含氮量光谱探测至关重要[17]。Gamon等对光化学植被指数（Photochemical Reflectance Index，PRI）进行了深入研究，研究表明，光合参数和PRI 会受到同等调节作用，并且PRI 还具有探测叶片Vcmax和气孔导度的潜力[18]。Zhou 通过研究混交林和阔叶林后发现，Vcmax与归一化差值植被指数（Normalized Difference Vegetation Index，NDVI）、增强型植被指数（Enhanced Vegetation Index，EVI）具有良好的相关关系，大部分相关系数能达到0.95，并且随着季节变化，Vcmax与二者的关系也具有一定差异[19]。Dillen 等通过研究2 个树种的叶片反射率和光合参数的季相变化，发现红边光谱指数与植被叶片Vcmax有较强的相关性，且氮素敏感光谱特征具有指示关键光合参数的潜力[20]。目前，关于Vcmax的研究多集中在林木，在作物上还鲜见报道，并且，植被叶片Vcmax易受植物本身的生物特性及环境影响。棉花是世界上重要经济作物和纤维作物，有关棉花叶片Vcmax对氮素的响应特性及采用高光谱技术估测Vcmax的效果尚不明确。为此，本文以棉花为研究对象，测量了不同施氮水平下各个生育时期的叶片生理参数和光谱反射率，研究了叶片含氮量、叶绿素等生理参数与叶片Vcmax的关系，同时筛选出能准确反演棉花叶片Vcmax的高光谱植被指数，结果对深化叶片最大羧化速率响应机理、提高氮素光能利用效率和提高光合作用模型模拟精度具有重要科学意义，同时为遥感估测叶片光合能力参数提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2018—2019 年在河北省保定市河北农业大学三分厂试验站（115°41′N，38°80′E）进行，试验地化学性质如表1 所示。试验品种选用棉花主栽品种国欣棉9号，分别于2018 年4 月28 日和2019 年5 月3 日播种，小区覆膜，设置4 个施氮水平，即0（N0）、120（N1）、240（N2）、480（N3）kg/hm2（常规施氮水平为120～240 kg/hm2）。其中50%作为基肥，50%在花铃期追施。P、K 肥基施，分别为P2O5135 kg/hm2，K2O 75 kg/hm2。每个小区面积66 m2，随机区组设计，重复3 次。其他管理措施同常规。

表1 试验地化学性质 Table 1 Chemical property of experimental site

1.2 测定项目与内容

1.2.1 反射光谱测定

选择晴朗无云的天气，9：00—11：00，使用HR-1024i光谱仪（美国SVC 公司生产），利用仪器叶夹（自带光源），测量顶部倒4 叶反射光谱。该光谱仪测量范围350～2 500 nm，通道数1 024 个，光谱分辨率3 nm，视场角为25°，测量前均进行白板校正。

1.2.2 光合参数测量和Vcmax计算

叶片反射光谱测定后，使用Li-6400 便携式光合系统（美国LI-COR 公司生产）测量棉花叶片的光合-CO2响应曲线（The Photosynthetic CO2Response Curve，A-Ci）。测量时间控制在9：00—11：00 和13：00—15：00 之间。A-Ci曲线参数设置：光强为1 500 μmol/(m2·s)，CO2浓度梯度为400、300、200、100、50、400、400、600、900、1 200、1 500 μmol/(m2·s)。测定完成后，采用R 语言，基于Farquhar 光合作用模型并校正到25℃，计算获得叶片Vcmax[2]。

1.2.3 生理参数测定

叶绿素含量：将待测植物叶片去除中脉，剪成0.5 cm2小块，称取0.1 g，放入试管中，加入95%乙醇10 ml，塞上胶塞，震荡后遮光浸提。期间不时摇动。待叶片变白（24～48 h）后比色。比色时以95%乙醇作为对照，在波长为665、649、470 nm 下比色，记录各波长下的消光值，然后计算获得叶绿素（Chlorophyllatb，Chl a+b，mg/g）含量。

比叶重：使用直径1 cm 的打孔器打取15 个小圆片，105 ℃杀青30 min，80 ℃烘干至恒重后测定叶片干质量。比叶重（Leaf Mass Area，LMA，g/cm2）即为叶片干质量和叶面积的比值。

叶片含氮量：将烘干后的叶片粉粹并研磨至粉末状。叶片全氮测量分为消煮和检测2部分，消煮采用H2SO4-H2O2法，使用连续流动分析仪（AA3，德国布郎卢比公司生产）测量叶片全氮含量（Total Nitrogen Content of Leaves，Nmass，mg/g）。

以上生理参数的测定在反射光谱测量和光合参数测量之后，且为同一叶片。

每个处理重复5 叶，各个生育时期测量1～3 次。每年除了各个生育时期测量之外，还进行3 次补充测量，每次测量对象为叶色由绿到黄的叶片，测量项目与生育时期测量一致。

1.3 高光谱指数选择

光谱指数主要与叶片色素、细胞结构以及植物中的液态水和营养状态等密切相关。为了使植被反射信息最大化，环境影响最小化，光谱指数的波段组合也参照一定的物理基础，如选用对叶绿素高吸收的红光波段和对绿色植被反射和透射的近红外波段、对氮素敏感的红、蓝光波段和受细胞结构多次反射散射影响的近红外平台区等。本研究根据棉花的光谱特点，结合前人研究，选取对叶绿素、氮素含量和比叶重敏感的光谱指数进行分析。光谱指数主要分为比值植被指数（Ratio Vegetation Index，RVI）和归一化差值植被指数（Normalized Difference Vegetation Index，NDVI）。具体计算公式见表2。

表2 光谱指数计算公式 Table 2 Spectral indexes computational formula

1.4 数据分析

使用一般线性回归和多元逐步回归建立生理参数与棉花叶片Vcmax、光谱指数与棉花叶片Vcmax的估算模型，建模数据包括所有生育期数据和补充测量数据，数据集划分遵循随机原则且覆盖各个生育时期，其中约75%数据（n=220）用作训练集，25%数据（n=80）作验证集。精度评价指标选用均方根误差（RMSE）和决定系数（R2），R2越接近1，RMSE 越小，说明模型参考价值的越高，Vcmax估算越准确。

2 结果与分析

2.1 不同施氮水平下棉花叶片Vcmax变化

由图1 可知，棉花叶片Vcmax随着季节变化呈现逐渐下降的趋势，在苗期最大。2018 年，从出苗后44 d（苗期）至93 d（花铃期），叶片Vcmax保持较高水平且各个处理间无显著差异（P>0.05），说明施氮水平的不同没有影响到叶片Vcmax。进入吐絮期，叶片Vcmax急剧下降，高施氮肥处理（N2、N3）的叶片Vcmax开始高于低施氮肥（N1）和不施氮肥处理（N0），且在最后一次测量（出苗后144 d）达到显著差异（P<0.05）。2019 年，叶片Vcmax表现与2018 年略有差异，叶片Vcmax在苗期至蕾期并未受到施肥处理的影响，而出苗后103 d（花铃期），高施氮肥下的叶片Vcmax就开始高于低施氮肥和不施氮肥处理，较2018 年提前20 d，并在出苗后122 d（吐絮期）达到显著差异。

图1 不同施氮水平下棉花叶片Vcmax 的季节性变化 Fig.1 Seasonal variatio le nv oefl sl ei anf c V oc tmtoaxn under different nitrogen

2.2 不同施氮水平下棉花叶片含氮量和叶绿素变化

由图2 可知，叶片含氮量随着季节变化呈现逐渐下降的趋势，在苗期或蕾期达到最大值。在2018 年，出苗后93 d（花铃期）之前，叶片含氮量并未随着施氮量的增加而提高，在此之后，高施氮肥效果开始明显，直至出苗后 128 d（吐絮期）后处理之间达到显著差异（P<0.05）；与叶片含氮量有所差异，叶绿素在出苗后84 d（蕾期）就逐渐体现出施肥效果，且高施氮肥可以使叶绿素在生育期后期保持较高水平。

图2 不同施氮水平下棉花叶片含氮量和叶绿素的季节性变化 Fig.2 Seasonal variations for leaf nitrogen and chlorophyll content under different nitrogen levels in cotton

2019 年，从出苗后73 d（蕾期）开始，高施氮肥下的叶片含氮量就显著高于低施和不施氮肥的处理（P<0.05），随着生育进程的推进，差异愈发明显；叶绿素表现与2018年表现基本类似，都在蕾期（出苗后73 d）表现出处理差异，且高施氮肥有利于叶绿素在生育期后期保持较高水平。

2.3 棉花叶片Vcmax估算模型的构建

2.3.1 棉花叶片Vcmax与生理参数关系

棉花叶片Vcmax与生理参数的相关关系如图3 所示。在2018 年，与叶片Vcmax相关程度最高的是叶片含氮量，模型拟合精度最高（R2=0.723），其次为叶绿素（R2=0.581），与比叶重关系最弱（R2=0.397）；2019 年，叶片Vcmax与生理参数的关系与2018 年表现一致。

基于2 a 数据建立了叶片含氮量和叶绿素与叶片Vcmax的一元线性回归模型和多元逐步回归模型，见式（1）～式（3）。比叶重与叶片Vcmax关系因相关关系较低，并未建模。

2.3.2 光谱指数与棉花叶片Vcmax关系

棉花叶片Vcmax与光谱指数的决定系数等高线图如图 4 所示。在NDVI 等高线图中，红边波段与蓝波段组合的光谱指数均具有较好的预测能力，红波段与蓝波段组合的光谱指数次之，其他波段组合预测能力较弱，其中决定系数最高的光谱指数为NDVI697,445（下标数字为2个波长，nm），R2达到0.752。RVI 等高线图与NDVI等高线图类似，决定系数最高的光谱指数为RVI445,694（下标数字为2 个波长，nm），R2达到0.760。

将前人研究所得的27 个植被指数（表2）与叶片Vcmax做相关性分析，结果如图5 所示。有7 个与叶片Vcmax极显著相关（P<0.01），其中相关程度最高的3个光谱指数分别是光化学植被指数（PRI）、改进叶绿素吸收植被指数（Modified Chlorophyll Absorption Ratio Index，MCARI）、修正型归一化差值植被指数（Modified Normalized Difference Vegetation Index，mND705），相关系数绝对值均大于0.6。使用训练集数据，以叶片Vcmax为因变量，将相关性表现最好的3 个光谱指数和本文筛选所得RVI445,694、NDVI697,445作为自变量，分别构建一元线性回归模型和多元逐步回归模型。回归模型如表3 所示，RVI445,694、PRI 和mND7053 个光谱指数构建的多元逐步回归模型精度最高（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)），且高于单变量回归模型。

图3 棉花叶片Vcmax 与含氮量、叶绿素和比叶重的相关关系 Fig.3 Correlation between nitrogen content, chlorophyll, leaf mass area and Vcmax in cotton leaves

图4 棉花叶片Vcmax 与光谱指数的决定系数等R2 高线图 Fig.4 Contour maps of coefficients of determination (R2) between Vcmax and spectral indices

图5 棉花叶片Vcmax 与光谱指数的相关系数 Fig.5 Absolute value of correlation coefficients between Vcmax and spectral index in cotton leaves

表3 训练集棉花叶片Vcmax 与光谱指数的反演模型 Table 3 Inversion models of Vcmax and spectral index in cotton leaves in training set

2.4 棉花叶片Vcmax估测模型精度检验

使用验证集数据检验所构模型精度如表4 所示。Nmass-Vcmax、S-MSR、R-NDVI697,445、R-RVI445,694和R-MSR模型决定系数R2均高于0.7，其中R-MSR 精度最高（R2=0.787，RMSE=19.36 μmol/(m2·s)），其他模型精度较低，误差较大。综上所述，用生理参数和光谱指数构建棉花叶片Vcmax估算模型是可行的，其中以光谱指数RVI445,694、PRI、mND705所构建的多元逐步回归模型要略优于以叶片含氮量和叶绿素构建的多元逐步回归模型。

表4 验证集棉花叶片Vcmax 真实值和估测值拟合结果 Table 4 Fitting result l se aovf eVs c imna x v t a rlui d e a atni o dn e s set itm ation value of cotton

3 讨 论

综合以上试验数据来看，棉花叶片Vcmax与叶片生理参数和光谱数据存在着密切关系，这与前人的研究一致[13-14]。洪帅等研究发现，即使在不施氮的条件下，土壤中的养分也足以供应棉花苗期的生长发育[36]。本试验同为施肥处理，但是由图2 可知，在2018 年，直至出苗后第84 天（花铃期），N0 处理下的棉花叶片含氮量并没有低于其他施肥处理；2019 年，经过1 a 的施肥累计效应，N2、N3 处理下的叶片含氮量在蕾期就显著高于N0、N1 处理。考虑到基础地力较高的前提下，认为土壤中的养分足以供应棉花苗期至蕾期的正常生长发育，掩盖了施肥效果。

闫霜等研究多个植被类型（不包含作物）的Vcmax后发现，随着季节推移，Vcmax往往表现出先升后降的季节变化趋势，其主要受到了LMA、叶片含氮量在Rubisco 的分配比例等影响[37]。而本研究表明，棉花叶片Vcmax随着季节变化呈现逐渐降低的趋势，在苗期达到最大值。此外，在2018 年苗期至花铃期和2019 年苗期至蕾期，各个施肥处理下的叶片Vcmax并没有显著差异，表明在基础地力较高的前提下，棉花叶片Vcmax在苗期至蕾期受施氮水平影响较小。并且，随着生育期的进行，高施氮肥下的叶片Vcmax开始逐渐高于低施和不施氮肥处理，氮素逐渐成为影响叶片Vcmax高低的关键因素之一，高施氮肥（240～480 kg/hm2）可以使棉花叶片在生育期后期维持一定的光合能力。结合叶片含氮量、叶绿素等生理参数的季节变化，可以看出叶片含氮量的季节变化趋势与叶片Vcmax的季节变化趋势较为相近，从侧面表明了Vcmax与叶片含氮量密切相关，与Miner 等的研究一致[38]。

叶片Vcmax作为决定光合能力的关键指标，其值的高低必然和叶片的生理状态和环境密切相关。作为调控Rubsico 合成、协调光合组分比例的主要成分，叶片含氮量与叶片Vcmax成为最早的研究热点。闫霜等通过研究不同功能型的植物叶片后发现，叶片含氮量与叶片Vcmax关系表现出一定差异性，其线性关系式的斜率平均值在16.29～50.25 μmol·g/(N·s)，大部分物种的叶片Vcmax随叶片含氮量和光合氮利用效率变化趋势相一致[37]。本研究结果表明，叶片含氮量与叶片Vcmax的相关程度最高，叶绿素与叶片Vcmax的相关程度次之，其他生理参数与叶片Vcmax的相关程度最低，两年情况一致。这与Croft 等发现叶片Vcmax与叶绿素关系更密切有所出入[13]，这可能受到棉花物种的影响，也有可能是大田独特环境的作用，毕竟叶绿素的多少与光合系统捕光组分的关系更加密切，而羧化系统受叶片含氮量的制约更为多一些[39]。此外，在以生理参数为自变量的叶片Vcmax估算模型构建中，以叶片含氮量和叶绿素为自变量的多元逐步回归模型精度和准确度均要高于其他单变量线性模型，表明叶片含氮量和叶绿素相结合可以更好的拟合叶片Vcmax，为叶片Vcmax的拟合提供新思路。

虽然目前还没有明确的光谱机理将叶片Vcmax和光谱反射率直接联系起来，但可以利用某些与叶片Vcmax的密切相关的生理参数的光谱来反演Vcmax。王亚卿为了估算长白山地区的Vcmax，推导建立了Vcmax与光能利用率的稳定关系，并利用光能利用率与光谱的相关性，改进了传统PRI，使其更适宜当地环境，可以更好的反演光能利用率和Vcmax[40]。本试验通过对叶片Vcmax和光谱指数进行回归分析发现，由红边波段与蓝波段组合的光谱指数可以较好的预测棉花叶片Vcmax，其中表现最好的光谱指数为NDVI697,445和RVI445,694。随后在以光谱指数为自变量的叶片Vcmax估算模型的构建中，由NDVI697,445和RVI445,694所构建的叶片Vcmax估算模型精度要远高于其他估算模型，R2均超过0.75。除此之外，由RVI445,694、PRI、mND705所构建的多元逐步回归模型精度最高（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)）。最后，在本试验所构建的棉花叶片Vcmax估算模型中，由RVI445,694、PRI、mND705所构建的多元逐步回归模型精度最高，叶片含氮量和叶绿素所构建的的多元逐步回归模型次之（R2=0.801，RMSE=17.01 μmol/(m2·s)），其他估算模型精度要稍弱；验证结果也是如此。综上所述，使用光谱数据构建棉花叶片Vcmax估算模型是可行的，且精度和准确性可以优于生理参数，拟合效果更好，为棉花叶片Vcmax光谱反演提供理论支持。因测定叶片A-Ci 时间较长，野外测量不可避免地受到光照、温度等环境条件的影响，是否会影响到模拟结果有待于进一步研究。另外，不同学者计算Vcmax采用的模型不尽相同，也可能对结果产生影响。

4 结 论

本研究以叶片生理参数和光谱数据为基础，揭示了氮素水平对棉花叶片最大羧化速率（Maximum Carboxylation Rate，Vcmax）的影响，构建了生理参数与棉花叶片Vcmax的估算模型，并根据本试验数据提出了与棉花叶片Vcmax拟合度高的光谱指数，同时分析了27 种前人光谱指数与棉花叶片Vcmax的相关关系，在此基础上选择相关关系较好的光谱指数构建线性回归和多元逐步回归模型，得出以下结论：

1）在基础地力较高的前提下，不施氮肥土壤中的氮素足以保证棉花叶片Vcmax在苗期至蕾期保持较高水平，随着生育期进行，氮素逐渐成为影响叶片Vcmax高低的关键因素之一；高施氮肥（240～480 kg/hm2）有助于棉花叶片Vcmax保持较高水平，在吐絮期尤为显著。

2）以叶片生理参数为自变量所构建的棉花叶片Vcmax估算模型中，由叶片含氮量和叶绿素所构建的的多元逐步回归模型精度最高（R2=0.801，RMSE=17.01 μmol/(m2·s)），高于由叶片含氮量、叶绿素所构建的单变量估算模型。

3）提取出与棉花叶片Vcmax拟合度高的光谱指数NDVI697,445和RVI445,694，筛选到与叶片Vcmax相关程度最高的3 种前人光谱指数PRI、MCARI 和mND705，分别构建一般线性回归和多元逐步回归模型，其中精度和准确度最高的是由RVI445,694、PRI 、mND705所构建的多元逐步回归模型（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)），高于其他单变量线性回归模型。