响应面法优化酶法提取亚麻蛋白工艺

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(1.河北北方学院食品科学系,河北张家口 075000)(2.河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室,河北张家口 075000)(3.张家口市食品药品检测中心,河北张家口 075000)

亚麻(Linumusitatissimum)别名为胡麻,是亚麻科、亚麻属一年生草本植物,主要分布在俄罗斯、加拿大、中国、印度和哈萨克斯坦等国家[1-2]。亚麻籽(flaxseed或linseed)即亚麻的种子,为红棕色果实,表面平滑有光泽,有极强的坚果风味[3]。亚麻籽含有蛋白质、油脂、木质素和亚麻胶等成分,其中脂肪含量为30%～40%,含有饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和大量的多不饱和脂肪酸;其中蛋白质含量为21.9%～38.6%,必需氨基酸种类齐全且评分较高,含有很高的营养价值;加工性能良好,可应用在食品中[4-7]。

目前我国油用亚麻产业比较薄弱,产品仅限于亚麻油,榨油之后的剩余物饼粕一般作为动物饲料,导致较高营养价值的植物性蛋白质资源没有得到有效的利用,阻碍了亚麻蛋白资源的开发以及在食品工业中的应用[8-12]。现在全球面临粮食危机,充分利用粮油加工副产物,挖掘亚麻籽饼粕的资源潜力,不仅可以增加粮食来源,还可以开发出新的食品资源,增加企业的经济效益,促进农民增收,推动农业产业化的发展[13-15]。

亚麻蛋白的提取方法有碱溶酸沉法,但是在较高的碱性环境下会破坏蛋白质的营养特性,并加深产品色泽[16]。近几年来开始用酶法提取蛋白质,具有反应条件温和、时间短、提取率高,能更多的保留蛋白质的营养功能等优点[17-18]。张慧君等[19]采用复合酶水解技术结合碱溶酸沉的方法从亚麻饼粕中提取亚麻蛋白,通过单因素和响应面试验对pH、时间、料液比、温度进行优化,最终的提取率达64.26%。

酶法提取蛋白质反应条件温和,能够避免碱溶酸沉法对蛋白质带来的负面影响。且能够更多的保留蛋白质的营养价值,所以本试验采用酶法亚麻籽饼粕中的亚麻蛋白。以榨油后的亚麻籽饼粕为原料,先进行脱脂、脱胶处理,然后在果胶酶、纤维素酶、植酸酶、α-淀粉酶各自最适的条件下进行筛选,以亚麻蛋白提取率为考察指标,选择提取率较高的酶。通过单因素试验和响应面法优化得到酶法提取亚麻蛋白的工艺条件,探讨加酶量、温度、浸提pH和时间4个因素对亚麻籽蛋白提取率的影响,确定最佳的工艺参数,为亚麻籽蛋白的进一步开发提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亚麻籽饼粕 来自康保明光粮油有限公司,外观整齐,无霉变;果胶酶(500 U/mg)、植酸酶(5 U/mg)、纤维素酶(50 U/mg) 上海赫鹏新生物科技有限公司;α-淀粉酶(≥3700 U/g) 北京奥博星生物技术有限公司;考马斯亮蓝-G250 北京亚米生物科技有限公司;牛血清蛋白 北京博尔西科技有限公司;石油醚、正己烷 天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钠 天津市永大化学试剂有限公司;无水乙醇 天津市风船化学试剂科技有限公司;盐酸 北京化工厂。

PHS-3C酸度计 上海佑科仪表有限公司;HC-3018高速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;79-1磁力加热搅拌器 常州澳华仪器有限公司;DS-T300高速多功能粉碎机 上海市顶帅工贸有限公司;UV76紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;HH-S数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂;HY-4A调速振荡器 常州澳华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 脱胶、脱脂亚麻籽饼粕的制备 参照张泽生等[20]的做法并稍作修改,亚麻籽饼粕粉碎过筛(80目),加入20倍的蒸馏水、温度为75 ℃,提取时间为90 min,洗胶次数为3次,进行脱胶。烘干亚麻籽饼粕加入30倍的正己烷,振荡6 h,回收正己烷,饼粕于通风橱晾12 h即为脱脂亚麻籽饼粕。

1.2.2 基本成分的测定 亚麻籽饼粕中脂肪的测定:根据《GB/T 5009.6-2016 食品中脂肪的测定》中第一法索氏抽提法测定;水分的测定:根据GB 5009.3-2016《食品中水分的测定》中第一法直接干燥法测定;粗蛋白的测定:根据GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中的第一法凯氏定氮法测定;灰分的测定:根据GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》中的第一法食品中总灰分的测定来测定;淀粉的测定:根据GB 5009.9-2016《食品中淀粉的测定》中的第二法酸水解法测定;纤维素的测定:根据GB/T 5515-2008《粮食中粗纤维素含量测定》中的介质过滤法测定。

1.2.3 亚麻蛋白提取工艺 称取1 g脱胶、脱脂亚麻籽饼粕粉,加15 mL 蒸馏水及酶,调pH至6,60 ℃水浴振荡3 h,100 ℃灭酶,4000 r/min离心15 min,考马斯亮蓝法测定上清液中的蛋白质含量(清蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.5%的NaCl溶液,振荡30 min,4000 r/min离心15 min,收集上清液测定蛋白质含量(球蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 70%的乙醇,振荡30 min,4000 r/min离心15 min,收集上清液测定蛋白质含量(醇溶蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.2%的NaOH,振荡30 min,4000 r/min离心15 min,收集上清液测定蛋白质含量(球蛋白)。然后将清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的含量加起来即为提取亚麻蛋白的含量。

1.2.4 最佳糖化酶的筛选 选α-淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶这四种糖酶水解亚麻蛋白,条件见表1,使酶活力达到2000 U/g,按各自最适合的条件下水解4 h,以亚麻蛋白的提取率为指标,筛选出最适合亚麻籽饼粕酶解的糖酶。

表1 各种酶的反应条件Table 1 Reaction conditions of various enzymes

1.2.5 单因素试验 根据1.2.4的筛选蛋白质提取率最高的一种酶,对酶的添加量、亚麻蛋白的提取温度、亚麻蛋白的浸提pH、亚麻蛋白的提取时间四个因素进行单因素实验。

1.2.5.1 加酶量对提取率的影响 称取亚麻籽饼粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸馏水,分别按原料的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%加入α-淀粉酶,在55 ℃下调节亚麻籽饼粕反应体系的pH为6,设定提取时间为3.5 h,确定适宜的添加剂量。

1.2.5.2 提取温度对提取率的影响 称取亚麻籽饼粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸馏水,按原料的2%加α-淀粉酶,分别在50、55、60、65、70、75 ℃下调节亚麻籽饼粕反应体系的pH为6.00,提取时间为3.5 h的情况下来选出最适的提取亚麻蛋白的温度。

1.2.5.3 pH对提取率的影响 称取亚麻籽饼粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸馏水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下分别调节亚麻籽饼粕反应体系的pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,设定时间为3.5 h的情况下来选出最适的提取亚麻蛋白的温度。

1.2.5.4 提取时间对提取率的影响 称取亚麻籽饼粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸馏水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下调节亚麻籽饼粕反应体系的pH为6,设定时间为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h的情况下来选出最适的提取亚麻蛋白的温度。

1.2.6 响应面试验 在单因素试验基础上,以加酶量(A)、提取温度(B)、提取pH(C)、提取时间(D)为因素,亚麻蛋白提取率(Y)为响应值,利用Design Expert 8.06软件,进行响应面的试验设计。响应面试验设计因素与水平见表2。

表2 响应面设计实验因素与水平Table 2 Experimental factors and levels of response surface design

1.2.7 亚麻蛋白提取率的测定和计算 亚麻籽饼粕中蛋白质含量采用凯氏定氮法测定。

提取蛋白质含量采用SN/T3926-2014《出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定》—考马斯亮蓝法[21],并用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品绘制标准曲线,测得蛋白的标准曲线为y=0.6177x-0.0063,R2=0.9933。

蛋白质提取率(%)=提取蛋白含量(g)/亚麻籽饼粕中蛋白质含量(g)×100

1.3 数据处理

数据处理采用Design Expert 8.06软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 亚麻籽饼粕基本成分的测定结果

随着人们生活水平的日益上升,人们对蛋白质的要求更高,因此不仅要开发新的蛋白质资源,还要加强对蛋白质功能性质的研究。大米的蛋白质含量约为8%,玉米的蛋白含量约为10%,高梁、燕麦等作物的蛋白质含量约在12%左右,谷糠蛋白含量在13%左右[22],而亚麻饼粕中蛋白质含量高达30.67%,且在我国一般作为动物的饲料或者是直接丢弃,所以说亚麻饼粕中的蛋白质具有一定的开发意义，其可作为优质蛋白质的来源[23]。

表3 亚麻籽饼粕基本成分Table 3 Basic components of flaxseed meal

2.2 筛选最佳酶制剂

如图1所示,亚麻蛋白的提取率从大到小表现为:α-淀粉酶(61.52%)>纤维素酶(56.63%)>植酸酶(55.26%)>果胶酶(47.46%)。因此选择α-淀粉酶做为提取酶制剂。因为各种酶作用底物不同,淀粉酶水解底物为淀粉,果胶酶水解底物为果胶,纤维素酶水解底物为纤维素,植酸酶水解底物为植酸,各种糖酶的活力不一。因此为保证酶的充分作用,将酶的添加量统一按酶底比添加。虽然淀粉酶的活性最低,但是它的作用效果最好,提取率最高。

图1 最佳糖酶筛选结果Fig.1 The best screening results of glycose

2.3 单因素实验结果

2.3.1 加酶量对蛋白质提取率的影响 由图2可知,当加酶量从1.0%增加至2.5%时,亚麻蛋白的提取率呈现快速上升趋势;当加酶量从2.5%增加至3.5%时,亚麻蛋白提取率呈平缓趋势。说明当α-淀粉酶的添加量较少时,α-淀粉酶能够与底物充分结合,当加酶量大于2.5%时,底物浓度过低,提取率不再上升。一般来讲,加酶量越高提取成本越大,因此加酶量采用2.5%为宜。

图2 加酶量对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of enzyme dosage on protein extraction rate

2.3.2 提取温度对蛋白质提取率的影响 由图3可知,当温度从50 ℃增加到60 ℃时,随着提取温度的不断升高,亚麻蛋白提取率呈现上升趋势;提取温度从60 ℃增加到75 ℃时,亚麻蛋白的提取率呈下降趋势,这可能与温度升高后蛋白质变性有关。所以选择60 ℃作为亚麻蛋白的提取温度。

图3 提取温度对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of temperature on protein extraction rate

2.3.3 pH对蛋白质提取率的影响 由图4可知亚麻蛋白提取率在pH5.0～7.5范围内的变化情况。pH的变化会影响带电性,的带电性直接影响蛋白质-蛋白质、蛋白质-溶液的相互作用,从而影响蛋白质的溶解性,最终影响蛋白质的提取率[24]。在试验pH范围内,当pH从5.0增至6.5时,随着pH的增加,亚麻蛋白的提取率呈现上升的趋势;当pH从6.5增至7.5时,随着pH的增加,亚麻蛋白的提取率呈现下降的趋势,因此较适宜pH为6.5。

图4 pH对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of pH on protein extraction rate

2.3.4 提取时间对蛋白质提取率的影响 由图5可知2.0～4.5 h内亚麻蛋白提取率的变化情况。当提取时间从2.0 h增至3.5 h时,随着提取时间的延长,亚麻蛋白提率呈现上升的趋势;当时间从3.5 h增至4.5 h时,随着提取时间的延长,亚麻蛋白提取率趋于平缓,不再上升。从经济方面来考虑,较合适的时间选为3.5 h。

图5 提取时间对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction rate

2.4 响应面对提取试验的优化

2.4.1 响应面试验设计及结果 在通过单因素获得最佳条件后,接着用Design-Expert.V8.0软件中的Box-Benhnken进行设计,以加酶量、提取温度、pH和提取时间为变量,以提取率为响应值进行分析,设计结果见表4。

表4 方案设计及响应面法试验结果Table 4 Scheme design and results of response surface method test

对表4中的数据用响应面软件进行方差分析,得到Y对A、B、C和D的二次多项回归模为:Y(%)=66.71+0.74A+0.30B+0.71C+1.52D-0.078AB-2.43AC+0.14AD-0.54BC+0.31BD+0.085CD-7.51A2-1.60B2-0.69C2-7.63D2,由表5可知,回归模型的P<0.0001,表现为极显著,失拟项P>0.05,表现为不显著,R2=0.9045>0.9,表明模型复合本次试验的结果,所以可以用此模型分析和预测提取亚麻籽饼粕中亚麻蛋白工艺的优化。

表5 实验结果的方差及显著性分析Table 5 Variance and significance analysis of the expeimental results

2.4.2 各因素交互影响分析 由图6可知,在α-淀粉酶提取亚麻籽饼粕中蛋白的工艺中,亚麻蛋白提取率随着各因素的增大而逐渐增,当亚麻蛋白提取率增至极值后,随着各因素的增大,提取率则逐渐减小。响应面的值影响越大的因素,那么该曲面就会越陡,各因素彼此之间交互影响的强弱大小是通过等高线的形状来反映的。用圆形和椭圆形分别来表示影响因素相互作用的不显著性和显著性[25]。影响亚麻蛋白提取率的主次顺序为:D>A>C>B。当酶的添加量一定时,提取温度变化对提取率影响不明显;当酶添加量不变时,亚麻蛋白提取率在4 h前增加,4 h后降低。当提取时间固定时,当添加的酶量约为2.5%时,亚麻蛋白的提取率最优。若添加的酶的量大于约2.5%,提取率不会发生显著变化。当pH一定时,随着提取时间的增长,提取率是不断上升的,当提取时间一定时,亚麻蛋白质的提取率随提取pH的增长无明显变化。

图6 各因素交互作用对影响的响应面及等高线Fig.6 Response flour and contour lines of interaction of various factors to influence

2.4.3 验证试验 响应面优化试验预测的最佳提取条件为:加酶量2.52%、温度60 ℃、pH6.04、时间4.06。理论值提取率为65.54%。为了检测模型的准确性,对最佳工艺条件进行验证。考虑到操作实际性,将条件进行修正,加酶量2.5%,温度60 ℃,pH6,时间4 h,进行三次试验取平均值,得到实际的亚麻蛋白的提取率为接近略低于理论值为64.15%,与预测值的相对误差是2.1%。说明建立的模型和实际情况比较符合。

3 结论

在单因素的基础上,利用响应面试验研究4个因素对亚麻蛋白提取率的影响,优化亚麻蛋白的提取工艺条件,根据响应面试验建立的二次多项式模型具有良好的显著性。α-淀粉酶提取亚麻籽饼粕中亚麻蛋白的最理想工艺条件为:α-淀粉酶用量2.5%,温度60 ℃,pH6,时间4 h,亚麻蛋白提取率为64.15%。同时,根据响应面分析,各影响因素对蛋白质提取率的作用大小依次为:提取时间>加酶量>pH>提取温度。虽然本文的提取率与张慧君等[19]得到的提取率相差不大,但是她的试验方法结合了碱溶酸沉法,据报道碱溶酸沉法对蛋白质的功能性质不利[26],酶法则能够更好的保留蛋白质的功能性质。用α-淀粉酶对亚麻籽饼粕进行脱胶、脱脂的预处理之后,再来提取亚麻蛋白质,为亚麻蛋白资源的进一步开发提供基础理论研究技术。