超声辅助低共熔溶剂提取苹果叶中的总黄酮

孔 方,李 莉,刘言娟

(临沂大学,山东临沂 276000)

中国是苹果生产大国,产量约为4100多万吨/年,约占全世界总产量的55%。与此同时,每年会产生大量的苹果叶,但这些苹果叶没有被充分利用,大多被掩埋或者焚烧,不仅浪费了资源而且污染了环境。而苹果叶的药用价值早有记载,《滇南本草》记载:敷脐上治阴症,又治产后血迷,经水不调,蒸热发烧,服之神效;贴火毒疮或汤火,烧灰调油搽之最良[1-2]。

已有研究报道,苹果叶中含有很多黄酮类化合物[2-3]。该类化合物具有诸多生物活性,主要包括:抗氧化[4-5]、保护心血管系统[6]、增强免疫[7]、抗肿瘤[8]、降低血糖[9]、抗菌[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、抗过敏[13]等。该类化合物在医药、化妆品、保健品和食品等领域均有广泛应用,是目前倍受关注的天然产物之一。对苹果叶总黄酮进行提取,既能实现对废弃资源的利用,也能更好地开发利用苹果叶总黄酮。新型低共熔溶剂(DES)是一种由氢键受体和氢键供体按一定比例混合后于一定温度下加热搅拌形成的透明、均一、稳定的溶液[14]。具有蒸汽压低、无毒性、可生物降解、溶解性和导电性优良、电化学稳定窗口宽等独特的理化性质,并且DES是多元体系,可以任意组合,更容易选择适合的组分,在很多领域有着广泛的应用前景[15-19]。DES在溶解能力方面具有独特的性质,可以有选择的对无机或有机物进行溶解,因此,在天然产物提取分离方面具有很好的应用价值。DES已在液液萃取、固相微萃取、高效液相色谱、逆流色谱等领域有较多的应用[20-23]。

本研究首先筛选对苹果叶总黄酮提取效果最佳的DES,研究超声温度、超声时间等参数对提取效果得影响,在此基础上,利用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken设计实验对提取工艺进行优化,确定超声波辅助DES提取苹果叶总黄酮的最佳工艺条件,以期为苹果叶资源的充分利用提供一定的技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果叶 采自山东省淄博市沂源县,洗净,于60 ℃烘箱中干燥2 h,粉碎过60目筛,备用;氯化胆碱、对甲酚、三氟乙酸 分析纯,阿拉丁试剂有限公司;丙三醇、乙二醇、三乙醇胺、95%乙醇 分析纯,天津恒兴化学制剂有限公司;芦丁 纯度98%,中国食品药品检定研究院。

KQ-250DB超声仪 昆山市超声仪器有限公司;TU-1810SPC紫外可见分光光度计 北京友仪四方科技有限公司;DF-1集热式磁力搅拌器 江苏金坛市金胜实验仪器厂;SHK-III型循环水式多用真空泵 郑州科泰实验设备有限公司;AB104电子分析天平 郑州南北仪器设备有限公司;DHG-9035A型电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科技有限公司;ST-06型300 g多功能粉碎机 永康市帅通工具有限公司;JIDI-20D台式高速离心机 广州吉迪仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制及总黄酮得率的测定 精密称取芦丁对照品10 mg,置于50 mL容量瓶中,用70%的乙醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得芦丁对照品溶液(0.2 mg/mL)。参照文献[24-25]方法进行回归方程、线性范围和相关系数的考察,具体实验过程如下:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法,以芦丁为对照品,于510 nm下测定吸光度A,以黄酮浓度C为横坐标,所测吸光度为纵坐标,绘制黄酮标准曲线,得线性回归方程、相关系数分别为:A=0.0127C-0.0016,R2=0.999。结果表明,芦丁对照品溶液在0.008～0.048 mg/mL浓度范围内呈现良好的线性关系。

参照文献[24-25]方法进行得率测定,具体实验过程如下:精密量取苹果叶提取液1.5 mL置于25 mL容量瓶中,用去离子水补足至10 mL,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,摇匀放置6 min;再加入1 mL 10%的Al(NO3)3溶液,摇匀放置6 min;最后加入4%的NaOH溶液10 mL,用去离子水定容,摇匀放置15 min,以芦丁为对照,于510 nm下测定吸光度,计算苹果叶总黄酮得率,计算公式如下:

式中:C:样品溶液测得吸光度所对应的标准曲线上的浓度,mg/mL;V1:样品溶液显色并定容后的体积,mL;V2:苹果叶总黄酮提取液的总体积,mL;V3:测吸光度时所吸取样品溶液的体积,即用于显色的样品溶液体积,mL;m:苹果叶粉末质量,g。

1.2.2 苹果叶总黄酮的提取 称取一定量的苹果叶粉末,按一定的液料比向其中加入具有一定含水量的DES,于超声波萃取仪中在超声功率为120 W时,按照一定的超声温度,超声一段时间。待苹果叶提取液冷却至室温后,在6000 r/min转速下离心10 min,弃去苹果叶残渣,按上述条件重复离心两次,收集上清液,即得苹果叶总黄酮提取液。

1.2.3 DES的优化

1.2.3.1 DES的制备 将氯化胆碱/乙二醇、氯化胆碱/丙三醇、氯化胆碱/三氟乙酸、氯化胆碱/对甲酚、氯化胆碱/三乙醇胺分别按摩尔比1∶2混合于圆底烧瓶中,在80 ℃油浴锅中搅拌1.5 h,直至形成透明均一的液体,所得产物即为DES。

1.2.3.2 DES组成体系的选择 固定提取剂与苹果叶粉末的液料比30∶1 mL/g、DES含水量10%、超声温度70 ℃、超声功率120 W和超声时间30 min,改变DES种类对苹果叶进行超声提取,提取液用“1.2.1”项下的方法进行含量测定,确定最优DES组成。

1.2.3.3 DES含水量的选择 利用“1.2.3.2”中筛选出的最优DES,配制成DES含水量分别为0、10%、20%、30%、40%和50%的提取溶剂,固定液料比30∶1 mL/g、超声温度70 ℃、超声功率120 W和超声时间30 min,对苹果叶进行超声提取,提取液用“1.2.1”项下的方法进行含量测定,确定提取效果最佳时的DES含水量。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 液料比对苹果叶总黄酮得率的影响 以氯化胆碱和三氟乙酸摩尔比1∶2制备DES,调节其含水量为30%,苹果叶粉末与DES提取溶剂的液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1和30∶1 mL/g,在超声功率为120 W,超声温度为70 ℃下超声提取30 min,计算苹果叶总黄酮得率,考察液料比对苹果叶总黄酮得率的影响。

1.2.4.2 超声温度对苹果叶总黄酮得率的影响 以氯化胆碱和三氟乙酸摩尔比1∶2制备DES,调节其含水量为30%,按苹果叶粉末与DES提取溶剂的液料比为20∶1 mL/g,超声功率为120 W,在超声温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃下超声提取30 min,计算苹果叶总黄酮得率,考察超声温度对苹果叶总黄酮得率的影响。

1.2.4.3 超声时间对苹果叶总黄酮得率的影响 以氯化胆碱和三氟乙酸摩尔比1∶2制备DES,调节其含水量为30%,苹果叶粉末与DES提取溶剂的液料比为20∶1 mL/g,在超声功率为120 W,超声温度为70 ℃条件下,分别超声提取10、15、20、30、40和50 min,计算苹果叶总黄酮得率,考察超声时间对苹果叶总黄酮得率的影响。

1.2.5 BBD设计试验 根据单因素实验的结果,以液料比(X1)、超声温度(X2)、超声时间(X3)3个因素作为变量,利用Design-Expert.V 8.0.6.1软件,以-1、0、1代表变量水平,进行BBD设计3因素3水平实验方案,独立变量的真实值与编码水平见下表1。

表1 BBD设计的因素水平Table 1 Factor level of BBD design

本实验选择3因素3水平的BBD结合响应面对试验参数进行进一步优化,以此来考察液料比(X1)、超声温度(X2)、超声时间(X3)3个因素不同水平组合下对黄酮得率的影响。总黄酮得率的二阶多元回归方程如下式所示:

式中,Xi,Xj表示独立的变量,Y表示响应变量,β0表示常数,βi表示一次项系数,βii表示二次项系数,βij表示交互项常数。

1.3 数据处理

所有实验平均进行3次。本研究利用Origin 8.5软件进行做图,采用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken对数据进行方差显著性处理和分析,所有实验数据全部以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 DES的确定

2.1.1 DES种类对苹果叶总黄酮得率的影响 提取溶剂对得率有很大的影响作用。不同溶剂因理化性质不同,提取所用时间以及所得得率也不同,因此选择合适的溶剂有利于有效成分的高效提取。本研究比较了5种DES对苹果叶总黄酮的提取效果,结果如下图1所示。

图1 DES种类对苹果叶总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of DES on the yield of total flavonoids from apple leaves注:1为氯化胆碱/乙二醇;2为氯化胆碱/丙三醇;3为氯化胆碱/三氟乙酸;4为氯化胆碱/对甲酚;5为氯化胆碱/三乙醇胺。

由图1可知,由氯化胆碱/三氟乙酸制备的DES对苹果叶总黄酮的得率最高,可达4.8%。这可能是由于氯化胆碱/三氟乙酸制备的DES具有较低的粘度,扩散系数比较大,流动性好,对细胞壁具有更好的渗透性,从而能实现对苹果叶总黄酮较好的提取效果。由氯化胆碱/乙二醇和氯化胆碱/丙三醇制备的DES粘度较大,对细胞壁的渗透性较差,所以对目标物的提取效果不理想。有研究表明,酚对位取代基的推电子性能够增强由氯化胆碱/酚所制备DES的氢键相互作用,从而导致体系的密度、黏度增加[26],因此,氯化胆碱/对甲酚DES的密度和粘度均较高,扩散性和流动性均较差,从而对细胞壁的渗透性不好,对目标物的提取效果差。本研究推测由氯化胆碱/三乙醇胺制备的DES可能由于自身组成和结构的原因导致其与目标物之间的作用力很弱,故对目标物的提取效果最差。因此,本研究选用氯化胆碱/三氟乙酸制备的DES进行后续实验。

2.1.2 DES含水量对苹果叶总黄酮得率的影响 DES可与水互溶,水可以改变DES的张力、极性和粘度等性质。一定的含水量能降低DES的粘度,同时由于水的加入使得被提取物质膨胀,使提取溶剂更容易渗透到植物细胞内部增大溶剂与被提取物质的接触面积,从而使其对目标物的提取更有利。

本研究改变DES含水量,考察其对总黄酮得率的影响,结果如下图2所示。由图2可知,随着DES含水量的增大,苹果叶总黄酮得率呈现先升高后下降的趋势,在含水量为30%时得率最高。这是由于含水量在一定范围内增大时可降低DES粘度,使其更有利于渗透进细胞,所以得率随之上升。达到最大值以后,含水量继续增加使得组成DES的两个组分浓度过低,两者之间不能形成氢键进而打破了DES体系,溶剂的理化性质被大大改变,越来越接近水的性质,使得率明显下降,因此本实验选取含水量为30%的氯化胆碱/三氟乙酸作为提取溶剂进行后续实验。

图2 DES含水量对黄酮得率的影响Fig.2 Effect of DES water content on yield of total flavonoids

2.2 单因素实验结果

2.2.1 液料比对苹果叶总黄酮得率的影响 实验结果如图3所示,在液料比小于20∶1时,苹果叶总黄酮得率随液料比的增大而呈上升趋势,20∶1时苹果叶总黄酮得率最大,之后开始下降。推测溶剂量的增加使物料与溶剂接触面积、溶液传质推动力均增大,浓度梯度变大,有利于黄酮的溶出,从而使其溶出速度和得率变大;而当溶剂增加过多时,大量溶剂的存在会消耗超声波的能量,使超声的效率下降,不能有效的击穿细胞,使有效物质的释放减少,造成黄酮得率下降。因此,本研究选择20∶1 mL/g为最佳液料比。

图3 液料比对苹果叶总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.2 超声温度对苹果叶总黄酮得率的影响 实验结果如下图4所示,在小于70 ℃的区间内,苹果叶总黄酮得率随温度的升高而增大,在70 ℃时,黄酮得率达到最大值,再继续升高温度时黄酮得率开始下降。随着温度的升高,一方面会使DES的粘度降低,另外DES的能量也增加,促进溶剂进入组织细胞,加速有效成分的释放;当达到适宜值后,温度升高得率反而下降,这是由于温度过高会使黄酮类成分结构发生破坏,从而使得率有所下降。因此,选择超声温度为70 ℃进行后续实验。

图4 超声温度对苹果叶总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of ultrasound temperature on the yield of total flavonoids from apple leaves

2.2.3 超声时间对苹果叶总黄酮得率的影响 实验结果如下图5所示,随着超声时间的延长,黄酮得率逐渐增大,以30 min为分界点,大于30 min后黄酮得率反而随着时间的延长而降低。出现该现象的原因可能是:时间延长,植物组织中的有效成分不断溶出,得率增加,到一定时间时,得率达到最高;提取时间继续延长,得率开始下降,这是因为长时间提取时,非黄酮类物质溶出增加,并且长时间超声可能会导致已溶出的黄酮类化合物发生分解。另外,超声时间越长造成的能耗越大,使提取成本大幅度增加,本研究选择30 min为最佳超声时间。

图5 超声时间对苹果叶总黄酮得率的影响Fig.5 Effect of ultrasound time on yield of total flavonoids from apple leaves

2.3 超声辅助DES提取苹果叶总黄酮的工艺优化

2.3.1 BBD与响应面试验结果 响应面试验设计及结果见表2,方差分析见表3。

表2 响应曲面设计试验与结果Table 2 Response surface design experiments and results

表3 响应曲面二次模拟方差分析Table 3 Response simulation surface quadratic simulation analysis of variance

利用Design-Expert 8.0.6软件对实验结果进行回归拟合,得到总黄酮得率(Y)对以上3个因素的二次多项回归模型:

2.3.2 响应曲面分析 响应曲面的陡峭程度及等高线形状反映两因素交互作用的显著程度,曲面越陡峭,等高线越接近椭圆,则两因素交互作用对响应值的影响显著;陡峭程度越小,等高线越近于圆形,则表示两因素交互作用对响应值无显著性影响,各因素之间的交互影响直观效果如下图6～图11所示。

如图6～图7所示,响应曲面相对平缓,等高线接近于圆形,说明提取温度和液料比的交互作用对响应值的影响不显著。黄酮得率随提取温度和液料比的递增先增加后减少,提取温度对总黄酮得率的影响大于液料比的影响。

图6 液料比-超声温度两因素交互作用对总黄酮得率影响的响应面图Fig.6 Response surface diagram of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

图7 液料比-超声温度两因素交互作用对总黄酮得率影响的等高线图Fig.7 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound temperature interaction on the yield of total flavonoids

如图8～图9所示,曲面陡峭,等高线形状接近椭圆,说明超声时间和液料比的交互作用对响应值的影响显著,曲面坡度说明液料比对于苹果叶总黄酮得率的影响大于超声时间。

图8 液料比-超声时间两因素交互作用对总黄酮得率影响的响应面图Fig.8 Response surface diagram of the effect of liquid and solid ratio and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

图9 液料比-超声时间两因素交互作用对总黄酮得率影响的等高线图Fig.9 Contour map of the effect of liquid-solid ratio and ultrasound time two-factor interaction on the yield of total flavonoids

如图10～图11所示,曲面陡峭,等高线形状近似椭圆,说明超声温度和超声时间的交互作用对响应值的影响显著,且曲面坡度表明超声温度对于苹果叶总黄酮提取率的影响大于超声时间的影响。

图10 超声温度-超声时间两因素交互作用对总黄酮得率影响的响应面图Fig.10 Response surface diagram of the effect of ultrasound temperature and ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

图11 超声温度-超声时间两因素交互作用对总黄酮得率影响的等高线图Fig.11 Contour map of the effect of ultrasound temperature-ultrasound time interaction on the yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工艺条件的确定 通过Design-Expert 8.0.6软件,依据数学回归模型对数据进行优化,得出最佳工艺参数为液料比22.84∶1 mL/g,超声温度为72.14 ℃,超声时间为26.53 min,预测总黄酮得率为7.23%。

为验证分析结果的可行性与可靠性,选取液料比23∶1 mL/g,超声温度72 ℃,超声时间27 min,进行验证实验,苹果叶总黄酮得率为7.06%,实际得率与预测得率相差2.35%,二者非常接近,表明该优化条件准确可靠。

3 讨论

本研究以DES为提取溶剂对废弃苹果叶中的总黄酮进行超声辅助提取,确定了提取效果最佳的DES为氯化胆碱/三氟乙酸,最佳含水量为30%。响应面结果表明,超声辅助提取苹果叶总黄酮的最佳工艺条件为:液料比23∶1 mL/g、超声温度72 ℃、超声时间27 min,按照该工艺进行提取,苹果叶总黄酮的平均得率为7.06%。研究结果表明,具有一定含水量的DES对黄酮类化合物具有较好的溶出效果,可将其应用于黄酮及其他天然产物的提取中。超声辅助DES提取苹果叶总黄酮具有操作简单、成本低、绿色环保等特点,本研究能为废弃苹果叶的开发利用提供一定的技术支撑和理论依据。