芍药苷调节高糖环境下线粒体相关内质网膜对雪旺细胞凋亡的影响

孙晓萌 李潇 朱笳悦 韩朔 杨鑫伟 许利平

糖尿病周围神经病变(Diabetic Peripheral Neuropathy,DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,其高发病率和高致残率严重影响人们的生活和质量,寻找治疗的有效药物,是目前一直研究和观注的重点。雪旺细胞(Schwann cells,SCs)作为周围神经系统的特有胶质细胞,在神经损伤与修复过程中发挥重要作用[1]。高糖环境下SCs的正常代谢过程被破坏,从而使神经毒性的终产物积累,影响神经营养因子,导致细胞凋亡[2]。已有研究表明芍药苷(paeoniflorin,PF)可以促进高糖培养的SCs的增殖,对抗高糖环境对SCs增殖的抑制作用[3],并有可能是潜在的神经生长促进因子[4]。课题组近期研究发现线粒体相关内质网膜(mitochondriaassociated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)参与了SCs的代谢过程,糖尿病周围神经病变的发病机制与MAMs密切相关,本实验以MAMs为切入点,围绕PF调控MAMs膜上功能蛋白和钙离子参与SCs凋亡,试图阐明PF对高糖环境下SCs凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和药品

雪旺细胞株RSC96,为中医络病研究北京重点实验室保存细胞株。

芍药苷,购于中国药品生物制品检定所,批号：110736-201035

1.2 主要试剂

葡萄糖(G8150,Sigma)；无水甲醇(20180226,北京化工厂)；PBS(P1020-500,Solarbio)；ER-tracker(P1041,Beyotime)；Mito-tracker(P1048,Beyotime)；高效RIPA组织/细胞裂解液(R0010-100,Solarbio)；anti-Mitofusin2抗体(ab124773,abcam)；DMEM(PM150210,Procell)；胎牛血清(16000-044,Gibco),DMSO(Sigma,D2650-100ml)。

1.3 主要仪器

手持式细胞计数仪(Millpore,AH01YOUQ)；低温离心机(Sigma,3K15)；超速离心机(BECKMAN,L-80XP)；高级研究型显微镜(Nikon,ECLIPSE 80i)；定制型流式细胞仪(Becton,Dickinson and Company,BD LSRFortessa)；激光共聚焦显微镜(Leica,TCS SP8)；透射电子显微镜(Hitachi,HD7700)；基础电泳仪电源(PowerPacTM),电泳槽(Mini-PROTEAN®Tetra),转印槽(Trans-Blot®),均来自Bio-Rad。

1.4 细胞处理、分组与蛋白样品提取

1.4.1 RSC96细胞复苏与传代 从-80℃低温冰箱中取出冻存细胞后迅速放入37℃水浴锅内温浴1分钟,将细胞悬液加入预先加过培养基的离心管内1000 r/min离心5分钟,弃上清,使用新鲜培养基重悬细胞沉淀,接种于新的培养瓶或培养皿内,常规培养。镜下观察细胞生长状态,接近长满时,用0.25%胰酶消化细胞1 mL,显微镜下观察细胞变圆并有部分脱落后,加入含血清培养基终止消化。反复吹打贴壁细胞,使其逐渐脱落并制成细胞悬液,接种于新的培养皿中。

1.4.2 实验分组及给药 取5个培养瓶分别标记为空白对照组,模型对照组,PF低、中、高剂量组。取RSC96细胞,胰酶消化后制成细胞悬液,采用手持细胞计数仪进行计数,每个培养瓶内加入5×106个细胞,贴壁培养12小时以上。配置空白对照组(25 mM glucose DMEM+10%FBS),模型对照组(150 mM glucose DMEM+10%FBS),PF低剂量组(150 mM glucose DMEM+10%FBS+1 μM PF),PF中剂量组(150 mM glucose DMEM+10%FBS+10 μM PF),PF高剂量组(150 mM glucose DMEM+10%FBS+100 μM PF)。取出贴壁的RSC96细胞,吸弃培养基,加入以上配置好的药品,置于37℃,5%CO2培养箱中分别培养24小时与48小时。

1.4.3 MAMs蛋白提取 采用胰酶将培养24小时与48小时的细胞消化成悬液后,转移至2 mL的离心管中。采用4℃低温冷冻离心机800 g,离心10分钟,取上清液转移至新的离心管中；更改离心条件为9000 g,离心10分钟,弃上清,用PBS将沉淀吹散；更改离心条件为10000 g,离心10分钟,重复2次后取沉淀；采用超速离心机设置为95000 g,离心30分钟。吸出大约距管底约1 cm处的漂浮于溶液中的环状絮状白色固体于离心管中,更改离心条件为6300 g,离心10分钟后取沉淀。再次采用超速离心法,更改条件为100000 g,离心30分钟,沉淀部分为MAMs蛋白。

1.5 观察指标

1.5.1 激光共聚焦观察MAMs形态与数量 取LAB-TekTMII腔室盖玻片8孔板,分别标记为空白对照组,模型对照组,PF低剂量组,PF中剂量组和PF高剂量组。取RSC96细胞铺板后贴壁生长12小时后,吸弃培养基加药,同1.4.2。吸弃培养液,每孔加入300 μL Mito-tracker工作液,于37℃孵育50分钟。PBS清洗3次后,加入ER-tracker工作液于37℃孵育30分钟。去除工作液,加入新鲜配置的细胞培养液。采用STED超高分辨率共聚焦显微镜观察活细胞。每组4个样本,每个样本随机选取6个区域,采用积分光密度法计数,将6个区域的均值作为每个样本的光密度。对Merge后线粒体标记蛋白和内质网标记蛋白重叠的部分,以积分光密度衡量含量,进行数据分析。

1.5.2 Western blot法检测线粒体融合蛋白2(Mitofusin2,Mfn2)表达 将含DTT的上样缓冲液与MAMs蛋白样品1∶3体积混合,于沸水变性。冷却后分装存放于-20℃待测。在10%SDS-PAGE凝胶孔中加入等量蛋白进行电泳分离,并使用湿转系统将蛋白转移到0.45 μm的PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温孵育2小时后采用MFN2抗体(1∶2000)4℃孵育过夜,TBST浸洗后,继续室温孵育山羊抗兔抗体1小时,使用TBST浸洗,加入超敏发光液后使用发光显影仪曝光。应用Image J软件对图片进行分析获得灰度值,以β-actin为内参,每组重复4次,计算相对蛋白含量。

1.5.3 Elisa法检测蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)蛋白表达 采用MAMs蛋白,取PERK ELISA试剂盒,于室温(20～25℃)放置30分钟。取出酶标板,按照标准品的次序依次分别加入100 μL的标准品溶液于空白微孔中。在空白微孔中加入100 μL样品,再加入10 μL平衡液。在各孔加入50 μL的酶标记溶液,37℃孵育1小时。充分清洗酶标板后,用吸水纸彻底拍干。各孔依次加入显色剂A 50 μL和显色剂B 50 μL。于20～25℃下避光反应10分钟后,加入50 μL终止液以终止反应。将微孔板置于450 nm波长的酶标仪下进行读数(吸光度值即为OD值)。每组重复4次,以标准品的OD值做标准曲线,将样品的数据带入标准曲线中获得蛋白含量。

1.5.4 流式细胞术检测细胞Ca2+水平 将细胞分为空白对照组,模型对照组,PF低、中、高剂量组；分别铺板加药后,孵育24小时和48小时(同1.4.2)。采用无EDTA胰酶消化细胞,并收集于2 mL离心管中。加入1 mL培养基,1000 r/min离心5分钟后,吸弃培养基。加入500 μL的Fluo-AM3(0.5 μm),将细胞吹打均匀,37℃孵育30分钟后,1000 r/min离心5分钟。吸弃250 μL上清液,继续加入250 μL的PBS,37℃孵育30分钟。1000 r/min离心5分钟后,吸弃上清液。加入500 μL的PBS,将细胞吹打均匀后,使用流式细胞分析仪进行细胞内Ca2+水平检测。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0进行统计分析,数据符合正态分布,以均数±标准差(±s)表示。多组样本比较采用单因素方差分析,方差齐性条件下,选择LSD分析,方差不齐性条件下,选择Tambane's T2分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PF对高糖环境下MAMs的形态与含量

SCs呈梭形,绿色部分为线粒体,由Mito-tracker标记；红色部分为内质网,由ER-tracker标记；重叠部分为MAMs。统计结果显示干预24小时和48小时后：与空白对照组比较,模型对照组MAMs含量显著降低(P＜0.01),SCs梭形不明显,形态变小不规则；与模型对照组比较,PF各组MAMs含量显著增加(P＜0.01),SCs形态得到改善,趋于棱形,见图1、图2 与表1。

图1 共聚焦观察24小时高糖环境下的MAMs形态(×630)

图2 共聚焦观察48小时高糖环境下的MAMs形态(×630)

表1 高糖环境下SCs中MAMs的共聚焦积分光密度(n=4,±s)

表1 高糖环境下SCs中MAMs的共聚焦积分光密度(n=4,±s)

注：与空白对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较,bP＜0.01。

1.00±0.12 1.00±0.09模型对照组 0.49±0.17a 0.52±0.12a PF 低剂量组 0.87±0.13b 0.89±0.19b PF 中剂量组 0.65±0.14b 0.78±0.10b PF 高剂量组 0.74±0.20b 0.69±0.11小时空白对照组组别 24小时 48 b

2.2 PF对高糖环境下MAMs中Mfn2表达

Mfn2低表达影响细胞代谢。RSC96细胞干预24小时和48小时后：与空白对照组比较,模型对照组Mfn2表达显著降低(P＜0.01)；与模型对照组比较,PF各剂量组Mfn2表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01),见表2。

表2 PF对高糖环境下MAMs中Mfn2的影响(n=4,±s)

表2 PF对高糖环境下MAMs中Mfn2的影响(n=4,±s)

注：与空白对照组比较aP＜0.01；与模型对照组比较bP＜0.01。

组别 24小时 48 1.00±0.13 1.00±0.10模型对照组 0.50±0.10a 0.59±0.10a PF 低剂量组 0.85±0.12b 0.82±0.16b PF 中剂量组 0.72±0.20b 0.80±0.11b PF 高剂量组 0.64±0.17b 0.70±0.10小时空白对照组b

2.3 PF对高糖环境下MAMs中PERK表达

PERK的过度激活会促进细胞凋亡。干预RSC96细胞24小时和48小时：与空白对照组比较,模型对照组PERK表达明显升高(P＜0.01)；与模型对照组比较,芍药苷低剂量组和芍药苷中剂量组PERK表达显著下降,差异有统计学意义(P＜0.01),芍药苷高剂量组表达也有明显下降(P＜0.05),见表3。

表3 PF对高糖环境下MAMs中PERK的影响(n=4,±s)

表3 PF对高糖环境下MAMs中PERK的影响(n=4,±s)

注：与空白对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较bP＜0.05,cP＜0.01。

组别 24小时 48 1.00±0.02 1.00±0.02模型对照组 1.44±0.10a 1.55±0.11a PF 低剂量组 1.18±0.09c 1.01±0.08c PF 中剂量组 1.25±0.09c 1.16±0.15c PF 高剂量组 1.30±0.12b 1.39±0.15小时空白对照组b

2.4 芍药苷对高糖环境下RSC96细胞Ca2+水平

Ca2+水平的上升是细胞凋亡的诱导因素之一。与空白对照组相比,模型对照组Ca2+水平显著升高(24小时升高3.63倍,48小时升高2.05倍,差异有统计学意义P＜0.01)。与模型对照组比较,芍药苷各剂量组均能够显著降低Ca2+水平,差异具有统计学意义(P＜0.01)；提示PF能够缓解高糖诱导的细胞Ca2+水平,见表4。

表4 PF对高糖环境下RSC96细胞Ca2+的影响(n=4,±s)

表4 PF对高糖环境下RSC96细胞Ca2+的影响(n=4,±s)

注：与空白对照组比较,aP＜0.01；与模型对照组比较bP＜0.01。

1.00±0.10 1.00±0.12模型对照组 3.63±0.12a 2.05±0.10a PF低剂量组 1.21±0.08b 1.06±0.09b PF中剂量组 1.61±0.09b 1.09±0.09b PF高剂量组 1.55±0.12b 1.15±0.08小时空白对照组组别 24小时 48 b

3 讨论

高血糖诱导的SCs病变是糖尿病周围神经病变的主要发病机制之一,SCs在神经损伤的修复中起着重要作用。氧化应激和内质网应激均能够引起SCs凋亡。高糖环境下未折叠蛋白的过度堆积引起内质网应激[5],激活内质网跨膜蛋白PERK,继而引发细胞凋亡[6-7]。

近年研究发现[8],线粒体外膜与内质网膜之间存在由特定蛋白质经由物理连接形成的亚细胞器结构,即MAMs。MAMs[9-10]经由内质网与线粒体相互调控,其机制与MAMs上多种功能蛋白和Ca2+信号密切相关。Mfn2作为线粒体外膜上一种跨膜GTP酶,介导线粒体融合,参与细胞能量代谢、增殖及凋亡等。研究还发现[11-12]Mfn2不仅参与调控线粒体形态结构,还与细胞代谢、增殖、凋亡密切相关。Mfn2能够引起下调Ca2+内流,缓解细胞内钙超载从而缓解细胞凋亡。PERK[13]是位于内质网膜上的一种跨膜蛋白,PERK信号通路的激活在内质网应激的早期可以通过抑制蛋白的合成发挥保护细胞的作用,促进细胞生存。但随着内质网应激时间的延长,PERK则会促进细胞的凋亡。SCs的凋亡影响周围神经功能,进一步影响糖尿病周围神经病变。已有研究[14]表明,Mfn2是PERK的上游调节剂,并在物理上与PERK相互作用,Mfn2损伤的细胞在基础条件下表现出PERK的持续激活。早期PERK能够使线粒体钙正常化,但后期则诱导内质网转流进入线粒体的Ca2+增加,促进钙超载,引发细胞凋亡。

赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.或川赤芍P.vertchiiLynch的根,在糖尿病周围神经病变的辨证论治中,结合糖尿病“阴虚为本,燥热为标”的特点,常配伍在复方中[15-16]用于治疗糖尿病周围神经病变。课题组前期研究[17]也发现,PF通过Nrf/ARE途径减轻线粒体氧化应激,降低SCs中氧自由基的含量,从而减轻SCs凋亡,保护周围神经而改善糖尿病周围神经病变。

本实验的结果示高糖环境下SCsCa2+明显增多,影响MAMs的形态和含量,引起细胞凋亡。结果还显示Mfn2表达下降,影响线粒体和内质网的形态异常；PERK表达的增加,也会导致细胞凋亡。Mfn2表达下降同时Ca2+增加,PERK表达也增加的现象证明Mfn2能够下调Ca2+,且能够下调PERK的表达。当用PF干预高糖环境的SCs后,影响MAMs的PERK表达量,48小时较24小时时间点的差异性更大,说明随着时间的增加,PF抑制PERK的表达更加明显,同时Ca2+水平下降更显著,具有一定的时效关系。PF干预后,Mfn2表达显著提升的同时表现为Ca2+水平显著下降,细胞凋亡缓解,MAMs的含量提升,PERK的表达降低,接近正常水平,表明PF通过上调线粒体相关内质网膜上 Mfn2的表达,而Mfn2能够下调PERK的表达,进而缓解钙超载,从而减轻SCs的凋亡,缓解糖尿病周围神经病变。

综之,PF能够改善高糖环境下SCs的MAMs的结构含量和功能蛋白,改善SCs形态,减轻SCs凋亡,有利于改善糖尿病周围神经病变。这与其能够上调Mfn2的表达,抑制PERK表达,降低细胞内Ca2+浓度,减轻钙超载有关。